Rat krös exteriorisering: En modell för utredning av de cellulära Dynamics inblandade i angiogenes

Summary

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Abstract

Microvacular nätverk tillväxt och remodellering är kritiska aspekter av sårläkning, inflammation, diabetesretinopati, tumörtillväxt och andra sjukdomstillstånd ^{1, 2.} Nätverk tillväxten vanligen tillskrivs angiogenes, definierad som tillväxt av nya fartyg från redan existerande kärl. Den angiogena processen är också direkt kopplat till arteriogenes, definierad som den kapillära förvärv av en perivaskulär cell beläggning och fartyg utvidgningen. Naturligtvis är angiogenes komplex och involverar flera spelare på cellulär och molekylär nivå ^3. Att förstå hur en mikrovaskulär nätverket växer kräver att identifiera de rumsliga och tidsmässiga dynamik längs hierarkin i ett nätverk under tidsförloppet av angiogenes. Denna information är avgörande för utvecklingen av terapier som syftar till att manipulera kärltillväxt.

Den exteriorisering som beskrivs i denna artikel är en enkel, reproducerbar modell för stimulerabiträda vid angiogenes i råtta tarmkäxet. Det var anpassad från sårläkande modeller på råtta tarmkäxet ^4-7, och är ett alternativ till att stimulera angiogenes i tarmkäxet via ip injektioner av proangiogena medel ^{8, 9.} Den exteriorisering modellen är attraktivt eftersom det kräver minimal kirurgiskt ingrepp och ger dramatiska, reproducerbara ökning av kapillär groddar, vaskulär området och vaskulär densitet under en relativt kort tid kurs i en vävnad som gör det möjligt att två-dimensionell visualisering av hela mikrovaskulära nät ner till enskild cellnivå. Det stimulerade tillväxten speglar naturliga angiogena svar i en fysiologisk miljö utan inblandning av utländska angiogena molekyler. Med immunohistokemiska märkningsmetoder är denna modell har visat sig vara ytterst användbara för att identifiera nya cellulära händelser som är involverade i angiogenes. Utredarna kan lätt korrelera angiogena statistik under tiden loppet av ombyggnad med tiden specific dynamik, såsom cellulära fenotypiska förändringar eller cellulära interaktioner ^{4, 5, 7, 10, 11.}

Protocol

1. Kirurgiskt ingrepp Set-Up Notes Före operationen sterilisera kirurgiska utrustning och instrument. Varor som används i sterila kirurgiska proceduren för varje råtta innefattar en drapering som skall läggas ut som en steril yta för placering av instrument, till en duk med en förskuren hål omkring 0,5 tum x 1,5 tum i centrum placeras över råtta och gasväv. Den förskurna hålet på duken inriktas med ett snitt på råtta. Instrument som behövs för operationen innefattar en standard sax för att användas för att skära suturmaterial, två pincett och en fin nål hållare för hantering och gripning av suturen, och en skalpell med ett blad. Vi har listat de vanligaste verktygen som används av vårt laboratorium i tabellen av särskilda kirurgiska material och verktyg. Beror dock slutligt verktygsval på försöksledaren preferenser. Förbered operation utrymme. Placera en 100 ml 0,9% steril saltlösning påsen under en värmedyna för att säkerställa att saltlösning som kommer i kontakt wte tarmkäxet vävnaden är i förväg uppvärmd till cirka 37 ° C. Som ett alternativ till, saltlösning, kan man använda Ringers lösning eller annan fysiologisk buffert. Lägg ut steriliserade kirurgiska instrument och tillbehör på en steril duk för enkel åtkomst under exteriorisering förfarandet. Dessutom behöver du sterila applikatorer bomull spets och lämpliga 3 typer av suturer (4-0, 5-0 och 7-0). Ser till att paketen i förväg öppnas så att materialen kan nås med steril hantering. Slutligen desinficera före-modifierade plast steg genom nedsänkning i 100% etanol under minst 5 minuter. Scenen är en 100 mm petriskål med en elliptisk håltagning i centrum (figur 1). En Dremel verktyget kan användas för att initialt framställa och, om nödvändigt, vidgas hålet. Efter att hålet är gjort, är kanterna på det skurna plast tillverkad jämn med sand papper av olika korn. Scenen tvättas sedan och slutligen antingen inert modellera (köpt från en lokal hantverk butik) eller silicpå lim läggs till hålets kant för att åstadkomma en upphöjd, jämn yta. Före kontakt med vävnaden, kommer scenen att behöva vara tillräckligt sköljdes med steril saltlösning. För denna modell av angiogenes, använder vi typiskt vuxna Wistar-hanråttor (350 ± 25 g). Andra råttstammar och åldrar kan användas. I vårt laboratorium, bedövas råttorna via intramuskulär injektion med ketamin (80 mg / kg kroppsvikt), xylazin (8 mg / kg kroppsvikt), och atropin (0,08 mg / kg kroppsvikt). Efter approximativt 5 minuter, är effekten av anestesi bekräftas och råttans bukhuden rakas. 2. Råtta tarmkäxet exteriorisering Modell Positionera sövd råtta på rygg på en värmedyna för att bibehålla kroppstemperaturen. Aseptiska tekniker används under den kirurgiska proceduren. Använd sterila handskar och tillåter inte instrument och tillbehör för att kontakta icke-sterila andra ytor än de råttvävnader. Rengör buken med omväxlande våtservetter USIng den sterila kompress indränkt i 70% isopropyl och jod. Använda skalpellblad, gör en liten (ungefär 0,75 tum) longitudinellt snitt längs huden och sedan linea alba ungefär 1 tum under sternum. Placera den förskurna svepas över buken sektionen så att öppningen i linje med snittet. Tryck försiktigt på runt snittet. Detta oftast kommer att resultera i exponering av tunntarmen nog för att lätt kunna identifieras. Använda applikatorer bomull spets försiktigt dra ut en del av tunntarmen och leta reda på ileum. Såsom tarmkäxet dras ut, bör det försiktigt anlagd på den plastiska fas (figur 2). Identifiera 6-8 vaskulariserade mesenteriska fönster. En mesenterial fönster definieras som tunt genomskinligt membran däremellan artären / ven par matar tunntarmen (figur 2). Anteckna starttiden för exteriorisering. Lämnar mesenterf sektionen exterioriserades i 20 minuter. Under exteriorisering perioden, använd en steril spruta (5 ml) för att intermittent fylla på salt i petriskålen för att säkerställa att vävnaden är nedsänkt och inte torkar ut. Under 20-minuters exponeringstid, markera de 2 centralt belägna mesenteriska fönster med steril 7-0 sutur. De märken bör göras i fettet område nära tarmen. Returnera exterioriserade regionen av tarmkäxet till bukhålan. Stäng buken muskeln med 5-0 monofilamentsutur i avbruten mönster. Stänga av huden med 4-0 monofilamentsutur i avbruten mönster. Torka av sys området med omväxlande dukar med hjälp av steril gasbinda indränkt i 70% isopropoyl och jod. Sprid gel ögonen smörjmedel på båda ögonen hos råtta. I syfte att smörja ögat är att förhindra uttorkning av hornhinnan under kirurgiska ingrepp och återhämtning. Tillämpningen av ögat smörjmedel bör tillämpasföre starten av kirurgiskt ingrepp. Om det behövs, re-tillämpa eye smörjmedel innan tillbaka råttan till sin bur för återvinning. 3. Tissue Skörd och fixering På dagen av intresse efter stimulering, bedöva och euthanize råttan. I vårt laboratorium, råttorna bedövas via intramuskulär injektion med ketamin (80 mg / kg kroppsvikt), xylazin (8 mg / kg kroppsvikt) och atropin (0,8 mg / kg kroppsvikt) och sedan dö genom intrakardiell injektion av beuthanasia. Beuthanasia är en pentobarbitalnatrium / fenytoin lösning som kan användas för snabb och smärtfri eutanasi. Per råtta vårt laboratorium injicerar vanligen 0,1 till 0,2 ml. Åter öppna bukhålan och ta försiktigt bort den lilla tarmen och leta reda på två-märkta fönster. Klipp ut varje exterioriserades mesenteriala fönster med pincett och mikroorganismer saxar. Inklusive en kant fett per fönster är fördelaktigt för senare vävnaden sprida på objektglas. Omedelbart, Fördjupa varje fönster i PBS. Vid skärning, försök att undvika att skära igenom artär / ven par i fettet gränsen av fönstren för att minimera risken blod fyllning av fönstren. Dessutom minimerar skärning genom tarmen vilket resulterar i tarminnehållet i kontakt med fönstren. Använd pincett för att sprida vävnader på positivt laddade objektglas. Två vävnader kan monteras per objektglas. Låt vävnaderna delvis torka och använda skalpellblad bort överflödigt fett. Vävnader är nu redo att fastställas. Typiska fixering metoder kan användas. I vårt laboratorium, fixa vi vanligen glasen i metanol (-20 ° C) i 30 minuter. Framgångsrik märkning har också utförts med ofixerade vävnader. Fixeringsmetoder kan bero på önskad antikropp. 4. Vävnad immunomärkning Vävnader kan i allmänhet nu märkas enligt instruktioner per antikropp för immunohistokemi. Med tanke på vårt intresse för att identifiera de rollerav vaskulära pericyter under angiogenes, märker vårt laboratorium ofta för endotelceller och perivaskulär cellerna 10, 12, 13. Användbara markörer för att identifiera endotelceller längs hierarkin av mikrovaskulära nätverk är en anti-PECAM-antikropp eller BSI-lektin. Perivaskulära cellmarkörer som används i denna vävnad innefattar NG2, desmin, SM-α aktin, PDFGRβ och klass III β-tubulin. Nedan i avsnitt 3,3, har vi listat protokoll för kolorimetriska och fluorescerande protokoll PECAM immunomärkning. Före den initiala primära antikroppen inkubation objektglasen är vakuumtorkades för att avlägsna överskott buffertlösning. Dessutom är vävnader initialt beskrivs tillsammans med ett vax penna för att förhindra okontrollerad strömning av antikroppslösningar bort från vävnadskontaktorganet. Vidare är alla märkning steg följt av tvättsteg. För tvätt steg, diabilder placeras inuti färgning burkar. Buffertlösningen utbyts 3 gånger under tvätten varaktighet. Endotelceller antikroppsmärkning procedurer: <p class = "jove_step"> PECAM Colorimetric Lableing Primär antikropp inkubation: Droppa ca 100-200 ml primär antikropp-lösning (1:200 musmonoklonal biotinylerad CD31 antikropp utspädd i antikroppsbuffert (0,1% saponin i PBS + 2% BSA)) ovanpå för att varje vävnad, se till att hela vävnaden är täckt med antikropp-lösning. Inkubation under 1 timme vid rumstemperatur. Tvätta vävnader med PBS 0,1% saponin under 30 minuter. Sekundär antikropp inkubation: Dropp sekundär antikroppslösning (Vectastain Elite ABC-lösning från Vector Laboratories, en streptavidin-peroxidas sekundär antikroppslösning) ovanpå vävnader. Inkubera vid rumstemperatur under 1 timme. Tvätta vävnader med PBS 0,1% saponin under 30 minuter. Inkubera vävnader med Vector Nova Red i 15 minuter. Sedan stiga vävnaderna med vatten. Mount bilder: Dip bilder i 95% etanol 10 gånger. Nedsänkas glider i 100% etanol under 2 minuter. Sänk ned objektglasen i ett annat 100% etanol såföroreningarna i 2 minuter. Sänk därefter ned objektglasen i rad 100% xylen lösningar för 2 minuter vardera. Låt torka och täcka vävnader med ett tunt skikt av VectaMount och ett täckglas. PECAM Fluorescerande Märkning Primär antikropp inkubation: Droppa ca 100-200 ml primär antikropp-lösning (1:200 musmonoklonal biotinylerad CD31 antikropp utspädd i antikroppsbuffert (0,1% saponin i PBS + 2% BSA)) ovanpå för att varje vävnad, se till att hela vävnaden är täckt med antikropp-lösning. Inkubation under 1 timme vid rumstemperatur. Tvätta vävnader med PBS 0,1% saponin under 30 minuter. Sekundär antikropp inkubation. Dropp sekundär antikroppslösning ((1:100 streptavidin-CY3 utspädd i antikroppsbuffert (0,1% saponin i PBS + 2% BSA)) på toppen av vävnader Inkubera vid rumstemperatur under 1 timme. Tvätta vävnader med PBS 0,1% saponin under 30 minuter. Mount bilder: Droppa 50:50 PBS med glycerol på toppen av vävnader. Täckmed täckglas. Använd sedan nagellack att täta mellanrummet mellan täckglas och objektglas. 5. Representativa resultat Representativa bilder av vävnader råtta tarmkäx immunohistokemiskt märkta för PECAM visas i figur 3. PECAM märkning identifierar alla typer av fartyg längs hierarki ombyggnader mikrovaskulära nätverk och kan användas för att kvantifiera angiogena mått vid vissa tidpunkter efter stimulering. PECAM märkning gör det också möjligt för bestämning av arterioler kontra venoler. Feeding arterioler uppvisar vanligtvis mindre diameter och långsträckta endotelceller morfologi jämfört med parade venoler (Figur 4). Kapillärer och kapillära groddar kan identifieras baserat på deras fartyg diameter och relativa position i ett nätverk. Typiska egenskaper för ombyggnad nätverk är ökad kapillär groning, kärl densitet vaskulariserad område och venular tortuoshet. Kvantifiering av olika angiogena mått identifierar tidsförloppet av nätverk tillväxt (Figur 5). Kapillär groning från redan existerande fartyg, toppar mellan dag 3 och dag 5 och återgår till den ostimulerade nivå Dag 10. Denna övergående ökning av spirande följs av ökningar i vaskulär densitet och vaskulariserad område. Som bevis för ombyggnad av större fartyg i denna modell, ökar antalet arteriol och venolen segmenten också över tidsförloppet. I vårt laboratorium, är denna modell användas för att identifiera cellulära fenotypiska förändringar vid specifik tidpunkt under denna process remodellering 10, 11. Till exempel identifierar klass III β-tubulin pericyter längs angiogena fartyg (Figur 6). I ostimulerade vävnader är klass III β-tubulin uttryck nerven specifik. I motsats härtill under toppen av kapillären groning, är klass III β-tubulin som uttrycks av perivaskulära celler. Denna typav resultatet belyser användningen av denna enkla och robusta angiogen modell för att identifiera nya celltyper är involverade i den angiogena processen. Figur 1. Bilder av plast scenen före och efter modifiering. Pre-modifierat steg är ett 100 mm petriskål. Ändringar inkluderar en elliptisk hål snitt i mitten och den efterföljande tillägg av modellera eller silikon lim för att hålets kant för att skapa en upphöjd, slät yta. Denna yta ger en inre gräns som underlättar superfusion av exterioriserades mesenteriala fönstren. Skala bar är 1 cm. Figur 2. Bild av exterioriserade mesenteriska regionen. Mesenteriska fönster definieras som de tunna genomskinliga membran mellan artären / blodkärl par matar tunntarmen. Under exterioriseringvaraktighet ligger mesenteriska regionen läggas ut och sänks ned i saltlösning i en modifierad petriskål. Inert gula modellera ger en jämn yta för krös att dras genom pre-cut hål. Skala bar är 1 cm. Figur 3. Representativa bilder av mesenteriska mikrovaskulära nätverk från ostimulerade vävnader och vävnader vid 3 och 10 dagar efter exteriorisering av tarmkäxet. PECAM märkning identifierade hierarki mikrovaskulära nät inklusive arterioler (A), venoler (V) och kapillärer (C). Inlägg stimulering, visade mikrovaskulära nätverk en ökad kapillär groning (pilspetsar) och fartyg densitet. Skalstrecket är 100 pm. Figur 4. Representativa bilder av arteriole / venolen par i vuxen råtta mesenterica mikrovaskulär nätets. I båda bilderna, kan arterioler (A) kan differentieras från venoler (V) baserat på en mindre relativ diameter och långsträckta endotelcell morfologi. Skala barer är 20 nm. Figur 5. Representant kvantifiering av angiogena statistik över tidsförloppet för mikrovaskulära tillväxt efter tarmkäx exteriorisering. A) Vaskulär yta per vävnadsarea. B) Antal kapillära groddar per vaskulär område. C) Total vaskulär längd per vaskulär område. * Representerar signifikant skillnad jämfört med ostimulerade grupp. Statistiska jämförelser gjordes med användning av en envägs ANOVA följt av Dunn test. (P <0,05). FN representerar ostimulerade. Figur 6. Representativa fluorescerande bilder av mesenteriska mikrovaskulära nätverk från ostimulerade vävnader och vävnader vid 3 och 10dagar efter exteriorisering av tarmkäxet. Immunofluorescens PECAM märkning (röd) identifierar endotelceller, och klass III β-tubulin märkning (grön) identifierar nerver (pilspetsar) och perivaskulära celler (pilar). Perivaskulära celler upregulate övergående klass III β-tubulin under kapillär groning. I ostimulerade mikrovaskulära nätverk är klass III β-tubulin nerv specifik och identifierar inte perivaskulära celler. 3 dagar efter stimulering, klass III β-tubulin märker positivt perivaskulära celler tillsammans mikrokärl. Vid dag 10, börjar klass III β-tubulin uttrycksmönstret för att återgå till ostimulerade scenariot. Skalstrecket är 50 pm. Figur 7. Bilder som stöder möjligheten att spåra i förväg märkta lokalt applicerade cellerna under mikrovaskulär nätet tillväxt stimuleras av tarmkäxet exteriorisering. Cellerna superfuseras över mesenteric fönster under 20-minuter exteriorisering period. 1 dag efter operation, Dil-märkta celler (röd) observerades i dame fokalplanet med PECAM positiva mikrokärl (grön). A, B) Exempel på Dil-märkta celler från benmärg som uppvisar rundade och långsträckt morfologier. I vissa fall (pilar) celler långsträckt utmed mikrokärl. C) Exempel på en grupp av Dil-märkta mesenkymala stamceller i närheten av spetsen av en kapillär gro (pil). Skalstrecken är 50 pm (A) och 20 ^ m (B, C).

Discussion

The exteriorization model was reported in 2006 and is adapted from previous mechanical injury rat mesentery models of angiogenesis^4-7 and produces similar results to well established i.p. injection models that take advantage of the rat mesentery⁹. The 20 minute exteriorization time was experimentally determined to produce a robust angiogenic response. While this time period could be varied, it does allow for local application of angiogenic inhibitors⁴ for mechanistic studies and direct application of exogenous cells for cell lineage studies. Feasibility of cell incorporation into remodeling mesenteric tissue is supported by preliminary studies in our laboratory using pre-labeled bone marrow cells and mesenchymal stem cells (Figure 7), and by the success of investigating the fate of human adipose-derived stromal cells injection i.p.¹⁴. In our laboratory, we have used this model to identify pericyte phenotypic changes over the time course of the angiogenic response¹⁰ and to assess the angiogenic potential during pathological conditions, such as hypertension¹². The angiogenic response and cell phenotype changes associated with this model can also be observed in other rat mesenteric angiogenic models including chronic hypoxia exposure^{10, 11}.

A limitation of the exteriorization model is that the exact triggering mechanisms of angiogenesis are unknown. Exteriorization of the mesentery has been linked to mast cell degranulation and increased histamine levels⁶, yet further investigation is required to gain more insight. The angiogenic stimulus is undoubtedly multi-factorial, producing a robust remodeling response across the hierarchy of a microvascular network. While the unknown mechanisms remain a major critique of this model, its reproducibility and simplicity make it attractive for identifying cellular dynamics involved in the inherently complex capillary sprouting process. The reproducibility of the model is supported by comparable angiogenic metrics over the time course of microvascular network growth across multiple rat strains (male Wistar and female Sprague-Dawley) in previously published studies from our laboratory^{10, 12}. Since, the majority of adult rat mesenteric tissues are vascularized, the model also allows for multiple tissues to be examined per animal. Unfortunately, this model is not obviously applicable to genetic mouse models as mouse mesenteric windows have less native vascularization and, in our experience, commonly lack observable branching networks. Future applications include the investigation of vessel functionality during angiogenesis using intra-vital microscopy at specific time points and the investigation of related cellular dynamics involved in lymphangiogenesis and neurogenesis. Though the extent of native vascularization per mesenteric window seems to be roughly proportional with age, we have observed branching microvascular networks in male Wistar rats as young as 4-5 weeks old. These observations suggest that the exteriorization model could also be applied to compare the angiogenic differences across ages.

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Additional Comments
Drape	Cardinal Health	4012	12″x12″ Bio-Shield Regular Sterilization Wraps
Noyes Micro Scissor	Roboz Surgical Instrument	RS-5677	Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge;0.25mm Tip Width, 4 1/2″ Overall Length
Graefe Forcep	Roboz Surgical Instrument	RS-5135	Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4″ Length
Graefe Forcep	Roboz Surgical Instrument	RS-5130	Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4″ Length
4-0 suture	ETHICON	699G	(1.5 metric) ETHILON Nylon Suture Black Monofilament
5-0 suture	ETHICON	8556	(1.0 metric) PROLENE Polyprolene Suture Blue Monofilament
7-0 suture	ETHICON	1647G	(0.5 metric) ETHILON Nylon Suture Black Monofilament
Castroviejo Micro Needle Holder	Fine Science Tools	12060-02	Tip Width:0.6mm Clamping Length:5mm Length:9cm Straight tip
Castroviejo Needle Holder	Fine Science Tools	12565-14	Tip Shape:Straight Tip Width:1.5mm Clamping Length:10mm Scissors:No Lock:Yes Length:14cm Serrated:Yes
Scalpel Handle	Roboz Surgical Instrument	RS-9843	Scalpel Handle, #3; Solid; 4″ Length
Sterile Surgical Blade	Cincinnati Surgical	0110	Stainless Steel; Size 10
Petri Dish	Fisher Scientific	08-757-13	Beveled Ridge, Slippable

Table of Specific Surgical Materials and Tools.

Name	Company	Catalogue Number	Additional Comments
Beuthanasia	Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply)	MWI #: 011168	Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium
Ketamine	Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply)	MWI #: 000680	Kateset 100 mg/ml
Xylazine	LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply)	MWI #: 009307	Anased 100 mg/ml
Saline	Hospira Inc.	94-217-JT
PBS	SIGMA	011M8207
Saponin	Sigma	BCBB4080
PECAM (CD31)	BD Pharmingen	553371
Streptavidin-CY3	Jackson ImmunoResearch	016-160-084
BSA	Jackson ImmunoResearch	096555
VECTASTAIN Elite ABC	Vector Laboratories	PK-6100
Vector Nova Red	Vector Laboratories	SK-4800
VectaMount	Vector Laboratories	H-500

Table of Specific Reagents