Metoder för att undersöka bidragen från nasofaryngealt-associerade lymforetikulära vävnaderna (NALT) till näsan och systemisk immunsvar hos möss mot intranasala vacciner beskrivs. Vi visar ett kirurgiskt förfarande för att fastställa en NALT-beroende musmodell och<em> Ex vivo</em> Kulturer av extraherat NALT.
Den nasofaryngeala-associerade lymforetikulära vävnaderna (NALT) som finns i människor, gnagare och andra däggdjur, bidra till immunitet i bihålorna 1-3. Den NALT är två parallella klockformade strukturer som finns i näsgångarna ovanför hårda gommen, och brukar anses vara sekundära komponenter i slemhinnan-associerade lymfoida systemet 4-6. Belägen inuti NALT är diskreta utrymmen av B-och T-lymfocyter uppblandade med antigen-presenterande dendritiska celler 4,7,8. Dessa celler är omgivna av en epitelcellskiktet inskjutna i M-celler som är ansvariga för antigenåtervinning från de mukosala ytorna av luftpassagerna 9,10. Naiva lymfocyter cirkulerar genom NALT är redo att svara på de första möten med respiratoriska patogener 7. Medan NALT försvinner hos människor vid en ålder av två år, Waldeyer ring och liknande strukturerade lymfatiska organ fortsätter att framhärda throughout liv 6. I motsats till människor möss behåller NALT hela livet, vilket ger en bekväm djurmodell för att studera immunsvar ursprung inom bihålorna 11.
Kulturer av encelliga suspensioner av NALT är inte praktiska på grund av låga utbyten av mononukleära celler. Emellertid kan NALT biologi undersökas genom ex vivo-odling av den intakta organ, och detta förfarande har den ytterligare fördelen av att bibehålla den naturliga vävnaden strukturen. För in vivo-studier, genetiska knockout modeller presenterar fel begränsas till NALT för närvarande inte tillgängliga på grund av en dålig förståelse för den utvecklande vägen. Till exempel, medan lymfotoxin-a knockout möss har förtvinat NALT är de Peyers plack, perifera lymfkörtlar och follikulära dendritiska celler och andra lymfoida vävnader också ändras i dessa genetiskt manipulerade möss 12,13. Som ett alternativ till möss gen knockout, kirurgisk ablation permanently eliminerar NALT från den nasala passagen utan att påverka andra vävnader. Den resulterande musmodell har använts för att fastställa förhållandet mellan NALT och immunsvar på vacciner 1,3. Seriell samling av serum, saliv, nasala tvättar och vaginala sekret är nödvändig för att fastställa grunden för värd svar på vaccination, medan immunsvar ursprung direkt från NALT kan bekräftas genom vävnadsodling. Följande procedurer beskriva de operationer, vävnadsodling och provtagning som behövs för att undersöka lokala och systemiska humorala immunsvar mot intranasal (IN) vaccination.
Vi har presenterat kollektiva metoder för att utveckla en djurmodell, att få biologiska prover och analyser för undersökning NALT-associerade immunsvar 1-4. Det finns ytterligare faktorer att tänka på under utförandet av dessa metoder. Standard sterila tekniker för kirurgi och vävnadsodling bör följas. En kombination av antibakteriella och svampdödande medel som används vid isolering och odling, samt behålla steriliserade instrument, arbetsområdet och desinfekteras gommar kommer att minska risken för kontaminering. Saliv, nasala tvättar och liknande slemhinnor prover sekretion bör inspekteras för eventuell kontaminering med blod, som serumantikroppar i allmänhet finns i högre koncentrationer. Vidare bör slemhinnesekret endast något utspädd för analys på grund av lägre koncentrationer av antikroppar är närvarande i dessa prover jämfördes med serum.
Möss ska hållas varm direkt efter operation för att preventilera potentiella anestesi-inducerad hypotermi. Alternativa vila möss på sina sidor under post-operation återhämtning för att minimera oregelbundna andning. Det kirurgiska ingreppet är mer effektiv med tre personer som arbetar tillsammans för att slutföra dessa uppgifter: en utföra operationen, en för att hjälpa till att hålla munnen öppen och en att ge postoperativ omvårdnad som mössen återhämta sig från anestesi.
Det är nödvändigt att använda H & E färgning av kraniala tvärsnitt vid slutet av alla experimentella procedurer eller studier för att verifiera framgång kirurgi för varje mus. Möjliga kirurgi resultat är: kompletta och bilateral NALT ablation, ofullständig ablation eller intakt NALT. Eftersom inte alla operationer kommer att resultera i fullständig förlust av NALT, djur med kvarstående eller intakt NALT kan användas som intern kontroll. En annan potentiell resultatet är att gommen inte helt läka, lämnar en öppning som förbinder nasala och orala kaviteter. Ofullständigläkning av gommen kommer att resultera i låg vikt och underlåtenhet att frodas, och dessa personer bör tas bort från studier.
Undersöka vaccin svar först med musen modellen användas för att fastställa en roll för NALT i avsedda studien utfallet (antikroppssvar, överlevnad, etc.). Kirurgiskt avlägsnande av NALT underlättar bestämningen av nasala bidrag till lokal och systemisk immunitet. Den kirurgiska metod som beskrivs här är den mest direkta metoden för att erhålla en musmodell som saknar NALT. Välj knock-out musmodeller har rapporterats sakna NALT, men dessa djur också har brist på cytokiner eller kemokiner är väsentliga för utvecklingen av andra sekundära lymfoida vävnader och kan hysa ytterligare fel 12,13. Vidare var de metoder som beskrivs här utvecklats för att undersöka flera aspekter av immunsvar har sitt ursprung i de näsgångarna. Våra experimentella resultat är baserade på studier med användning av hela den övre Palate från mus för vävnadsodling, fastän det är möjligt att sektionerna kan användas. Slutligen är det odlade NALT modell användbar för att utföra experimenten helt i vävnadskultur.
The authors have nothing to disclose.
Stöd kom från Becton Dickinson Technologies. Åsikter uttryckta i denna ansökan är de som av författarna och inte anspråk på att spegla officiella politik den amerikanska regeringen. Undersökningen genomfördes i enlighet med djurskyddslagen och andra federala lagar och andra författningar som rör djur och experiment med djur och följer principerna i Guide för vård och användning av försöksdjur, National Research Council, 1996. Anläggningen där denna forskning bedrivs är fullt ackrediterad av Föreningen för bedömning och ackreditering av försöksdjur Care International.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, No. 11 | Miltex | 4-311 | |
Knife Handle, No. 3 | Miltex | 4-7 | |
48-well Cell Culture Plates | Costar | 3548 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Gibco/Invitrogen | 16000-044 | Final Conc: 10% by volume in culture media |
Streptomycin Sulfate | Sigma | S9137 | Final Conc: 100 μg/mL |
Penicillin | Sigma | P7794 | Final Conc: 100 UI/mL |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | Final Conc: 50 μg/mL |
Fungizone | Gibco/Invitrogen | 15290-018 | Final Conc: 1 μg/mL |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Conc: 10 mM |
Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022364111 | |
Nutra-gel Cherry Flavored Mouse Wet Food | Bio-Serve | S4798-TRAY | |
Metacam | Boehringer Ingelheim | 601531000 | One drop of 1.5 mg/mL Oral Suspension |
Ketamine | Pfizer | 00856440301 | Final Conc: 6.06 mg/mL |
Acepromazine | Vedco | VEDC207 | Final Conc: 0.061 mg/mL |
Xylazine | Lloyd | 4811 | Final Conc: 0.667 mg/mL |
Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | 1621 | |
0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter | 2B1302 | |
0.5 mm Microcurette | Roboz | RS-6350 | |
Thermal Cautery Unit | Geiger | 150-S/150A-S | |
TCU Replacement Tip, Straight Fine Loop | Geiger | 214 | |
Surgical Scissors | |||
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma | HT501128 | |
Formic Acid | Fisher | A119P-4 | Mix 426 mL formic acid into 1047 mL tap water, then add 45 mL Rexyn 101 (H) |
Rexyn 101 (H) | Fisher | R231-500 | |
Tissue-Tek VIP E150/E300 | Sakura | ||
Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma | MHS16-500ML | |
Gill No.1 Hematoxylin | Sigma | GHS116 | |
Eosin B | Sigma | 2853 | |
Microtainer Serum Separator | BD Medical | 365956 | |
Phosphate Buffered Saline | 100 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4 | ||
Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free | Thermo Scientific | 78415 |