في Electroporation المختبر من شفة السفلى المعينية من أجنة الفئران Midgestation
Summary
هذه الدراسة توضح وضع<em> في المختبر</em> تقنية electroporation التي تسمح للتلاعب في التعبير الجيني في الشفة السفلى معيني الشكل من الأجنة midgestation.
Abstract
الشفة المعينية هو الظهارة العصبية الجنينية الموجودة في الدماغ المؤخر على مفترق الطرق بين الأنبوب العصبي وroofplate من البطين الرابع (استعرضت في 1). ويمكن تقسيم الشفة المعينية إلى الشفة العليا والمعينية (URL) الذي يضم قسيم معيني 1 (R1) وتولد الخلايا العصبية في المخيخ، والشفة السفلى المعينية (LRL) والذي يؤدي إلى تنوع السلالات الدماغ العصبية 2-4. وتشمل المشتقات LRL الخلايا العصبية السمعية من نوى القوقعة وتلك التابعة للنوى precerebellar التي تشارك في تنظيم التوازن والتحكم في المحركات 5-8. تكوين الخلايا العصبية من خلال LRL يحدث النافذة الزمنية الكبيرة التي تشمل أيام الجنينية (E) 9،5-16،5 5 و 9. الأنساب العصبية المختلفة على الخروج من LRL كخلايا تالية للتفتل (أو يولدون) خلال أيام تنموية متميزة خلال هذه النافذة العصبية.
ويمكن استخدام Electroporation من بنيات التعبير الجيني للالتلاعب في التعبير الجيني في LRL الأسلاف، ويمكن تغيير محتمل في مصير الخلايا العصبية التي تنتج من هذه المنطقة 10-12. وكان تغيير الجينات من الأسلاف LRL في الماوس عبر في الرحم electroporation ناجحة للغاية لمعالجة الأنساب ولدت في يوم الجنينية E12.5 أو 10 في وقت لاحق، 12-14. في electroporations الرحم قبل E12.5 لم تكلل بالنجاح في المقام الأول نظرا ل الفتك المرتبطة ثقب roofplate البطين الرابع، خطوة ضرورية في تقديم الحمض النووي الخارجية التي يتم electroporated في LRL. ومع ذلك، فإن العديد LRL الأنساب المستمدة تنشأ من LRL في وقت سابق من E12.5 9. هذه النسب في وقت سابق من مواليد تشمل الخلايا العصبية التي تشكل شبكي الوحشي، الإسفينية الخارجية، ونوى الزيتونية السفلية للنظام precerebellar التي تعمل على ربط مدخلات من النخاع الشوكي والقشرة في المخيخ 5. من أجل التعامل مع التعبير في LRLمن الأجنة الذين تقل أعمارهم عن E12.5، قمنا بتطوير نظام 1 في المختبر في الأجنة التي يتم وضعها في الثقافة بعد electroporation.
تقدم هذه الدراسة وسيلة فعالة وفعالة من أجل التلاعب في الجينات من الأسلاف LRL في E11.5. الأجنة electroporated مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP) طردوا من المروج CAG نشط على نطاق واسع وأعرب بتكاثر GFP بعد 24 ساعة من ثقافة. وهناك جانب حاسم من هذا الفحص هو أن يتم تبديل فقط التعبير الجيني بسبب التعبير عن الجينات خارجية وليس بسبب الآثار الثانوية التي تنتج عن electroporation وتقنيات زراعة. وقد تقرر أن أنماط التعبير الجيني الذاتية لا تزال دون عائق في الأجنة electroporated والمثقفين. ويمكن استخدام هذا الاختبار لتغيير مصير الخلايا الناشئة من LRL الأجنة الذين تقل أعمارهم عن E12.5 من خلال إدخال البلازميدات لoverexpression أو هدم (من خلال رني) من مختلف الموالية للعوامل النسخ العصبية.
Protocol
Discussion
وفي تقنية electroporation المختبر التي قدمت في هذه الدراسة هو منهج الرواية التي يمكن استخدامها بكفاءة لمعالجة الجينات في الأجنة الذين تقل أعمارهم عن 12 يوما من الحمل. وضع الأجنة في الثقافة يسمح التعبير عن الجينات المدخلة وتلتف على الفتك لاحظ عندما يسمح لأجنة electropora…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر جين جونسون لNgn1، Math1، والأجسام المضادة Ptf1a وكوني Cepko لpCAG :: GFP البلازميد. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة 1R15HD059922 R15-01.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Cryostat | Leica | CM-1850 | |
| Biologie tip Dumoxel treated DUMONT forceps | Fine Scientific Tools | 11252-30 | |
| 20 mm MORIA perforated spoon | Fine Scientific Tools | 10370-17 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation Generator | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* Electrodes | BTX (Fisher) | BTX450165 | |
| Fisher Isotemp CO2 Incubator | Fisher | 1325525 | |
| NAPCO CO2 Gas Regulator | Fisher | 15497020 | |
| 12 Well Tissue Culture Plates | BD Falcon (Fisher) | 877229 | |
| HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); With L-Glutamine and HEPES; 500mL | Thermo Scientific (Fisher) | SH3002301 | |
| HyClone* Donor Equine Serum | Thermo Scientific (Fisher) | SH3007402 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated | Invitrogen | 16140-063 | |
| cellgro* 10,000 IU Penicillin, 10,000μg/mL Streptomycin | Mediatech (Fisher) | MT-30-002-CI | |
| HyClone* L-Glutamine L-Glutamine; 200mM in 0.85% NaCl | Thermo Scientific (Fisher) | SH3003401 | |
| Fast-Green | Fisher | AC41053-0250 | 0.01% |
References
- Ray, R. S., Dymecki, S. M. Rautenlippe Redux — toward a unified view of the precerebellar rhombic lip. Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function. , (1997).
- Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. M. Assembly of the brainstem cochlear nuclear complex is revealed by intersectional and subtractive genetic fate maps. Neuron. 50, 205-218 (2006).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Rodriguez, C. I., Dymecki, S. M. Origin of the precerebellar system. Neuron. 27, 475-486 (2000).
- Taber-Pierce, E. Histogenesis of the nuclei griseum ponitis, corporis pontobulbaris and reticularis tegmenti pontis (bechterew) in mouse. J. Comp. Neurol. 126, 219-240 (1966).
- Dipietrantonio, H. J., Dymecki, S. M. Zic1 levels regulate mossy fiber neuron position and axon laterality choice in the ventral brain stem. Neuroscience. 162, 560-573 (2009).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Taniguchi, H., Kawauchi, D., Nishida, K., Murakami, F. Classic cadherins regulate tangential migration of precerebellar neurons in the caudal hindbrain. Development (Cambridge, England). 133, 1923-1931 (2006).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development (Cambridge, England). 133, 1113-1123 (2006).
- Okada, T., Keino-Masu, K., Masu, M. Migration and nucleogenesis of mouse precerebellar neurons visualized by in utero electroporation of a green fluorescent protein gene. Neuroscience research. 57, 40-49 (2007).
- de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla. Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).
- Landsberg, R. L. Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6. Neuron. 48, 933-947 (2005).
- Hoshino, M. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
- Yamada, M. Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on. Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).
