In-vitro-Elektroporation von der Unteren Rhombischer Lip von der Schwangerschaft ab muriner Embryonen
Summary
Diese Studie beschreibt die Entwicklung eines<em> In-vitro-</em> Elektroporation Technik, die für die Manipulation der Genexpression in der unteren rhombischen Lippe Schwangerschaft ab Embryonen erlaubt.
Abstract
Das rautenförmige Lippe ist eine embryonale Neuroepithels im Rautenhirn an der Verbindungsstelle zwischen dem Rohr und dem neuronalen roofplate des vierten Ventrikels (Übersicht in 1) angeordnet ist. Die rhombischen Lippe in den oberen rhombischen Lippe (URL), die Rhombomer 1 (R1) umfasst und erzeugt Neuronen des Kleinhirns und des unteren rhombischen Lippe (LRL), die Anlass zu vielfältigen neuronalen Hirnstamm Linien 2-4 unterteilt werden. LRL Derivate umfassen die auditorischen Neuronen des Cochlea-Kerne und die der precerebellar Kerne, die bei der Regulierung der Balance und motorische Kontrolle 8.5 beteiligt sind. Neurogenese aus dem LRL tritt über eine große zeitliche Fenster, das embryonalen Tag (E) 9,5 bis 16,5 5, 9 umfasst. Unterschiedliche neuronale Linien ergeben sich aus der LRL als postmitotischen Zellen (oder geboren sind) während der verschiedenen Entwicklungs-Tag während dieser neurogenen Fenster.
Elektroporation von Genexpression Konstrukte können verwendet werdenManipulation der Genexpression in LRL Vorläuferzellen und kann potentiell verändern das Schicksal der Neuronen aus dieser Region von 10 bis 12 produziert. Veränderung der Genexpression von LRL Vorläuferzellen der Maus über die in utero Elektroporation ist sehr erfolgreich für die Manipulation von Linien an embryonalen Tag E12.5 oder später 10, 12-14 geboren. In utero Elektroporationen vor E12.5 erfolglos waren in erster Linie auf die Letalität mit Punktion des vierten Ventrikels roofplate, ein notwendiger Schritt bei der Bereitstellung von exogenen DNA, die in die LRL elektroporiert assoziiert ist. Allerdings ergeben sich viele LRL abgeleitet Abstammungslinien von der LRL früher als E12.5 9. Diese früher geboren Linien sind die Neuronen, die den lateralen retikulären umfassen, externe keilig, und olivaris inferior Kerne der precerebellar System, das auf Eingaben aus dem Rückenmark und Cortex zum Kleinhirn 5 verbinden funktionieren. Um zu manipulieren Expression in der LRLvon Embryonen jünger als E12.5, entwickelten wir ein in vitro System, in dem Embryonen in Kultur nach Elektroporation platziert werden.
Diese Studie stellt eine effiziente und effektive Methode zur Manipulation der Genexpression von LRL Vorläuferzellen bei E11.5. Embryonen mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) aus der aktiven weitgehend CAG-Promotor gesteuert elektroporiert reproduzierbar GFP exprimierten nach 24 Stunden Kultur. Ein kritischer Aspekt dieses Assays ist, dass die Genexpression wird nur wegen der Expression des exogenen Gens und nicht wegen Nebenwirkungen verändert, die durch die Elektroporation und Kulturverfahren. Es wurde festgestellt, dass das endogene Gen-Expressionsmuster ungestört bleiben in elektroporierte und kultivierten Embryonen. Dieser Test kann verwendet werden, um das Schicksal von Zellen, die aus dem LRL von Embryonen jünger als E12.5 durch die Einführung von Plasmiden zur Überexpression zu verändern oder knock down (durch RNAi) werden von verschiedenen pro-neuronalen Transkriptionsfaktoren.
Protocol
Discussion
Die In-vitro-Elektroporation Technik in dieser Studie vorgestellt ist eine neuartige Methodik, die effizient genutzt werden können, um die Genexpression in Embryonen zu manipulieren jünger als 12 Tagen der Trächtigkeit. Die Platzierung der Embryonen in Kultur erlaubt die Expression des eingeführten Gens und umgeht die Letalität beobachtet, wenn elektroporierten Embryonen erlaubt, in vivo bleibt. Diese Technik erlaubt die Manipulation der Genexpression in der embryonalen Vorläufer, die bisher nich…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Jane Johnson für die Math1, Ngn1 danken und Ptf1a Antikörpern und Connie Cepko für die pCAG :: GFP-Plasmid. Diese Arbeit wurde vom NIH R15 1R15HD059922-01 finanziert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Cryostat | Leica | CM-1850 | |
| Biologie tip Dumoxel treated DUMONT forceps | Fine Scientific Tools | 11252-30 | |
| 20 mm MORIA perforated spoon | Fine Scientific Tools | 10370-17 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation Generator | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* Electrodes | BTX (Fisher) | BTX450165 | |
| Fisher Isotemp CO2 Incubator | Fisher | 1325525 | |
| NAPCO CO2 Gas Regulator | Fisher | 15497020 | |
| 12 Well Tissue Culture Plates | BD Falcon (Fisher) | 877229 | |
| HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); With L-Glutamine and HEPES; 500mL | Thermo Scientific (Fisher) | SH3002301 | |
| HyClone* Donor Equine Serum | Thermo Scientific (Fisher) | SH3007402 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated | Invitrogen | 16140-063 | |
| cellgro* 10,000 IU Penicillin, 10,000μg/mL Streptomycin | Mediatech (Fisher) | MT-30-002-CI | |
| HyClone* L-Glutamine L-Glutamine; 200mM in 0.85% NaCl | Thermo Scientific (Fisher) | SH3003401 | |
| Fast-Green | Fisher | AC41053-0250 | 0.01% |
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