Midgestation 마우스 태아의 아래쪽 사방 정계 립의 시험 관내 Electroporation에
Summary
이 연구의 발전을 설명<em> 체외에서</emmidgestation의 배아의 하단 마름모꼴의 입술에서 유전자 발현의 조작을 허용> electroporation 기술.
Abstract
마름모꼴의 입술은 신경 튜브와 넷째 뇌실 (1 검토)의 roofplate 사이의 교차점에서 hindbrain에있는 배아 neuroepithelium입니다. 마름모꼴의 입술은 rhombomere 1 (R1)을 포함하고 소뇌의 뉴런의 연결을 다양한 brainstem의 lineages 2-4로 상승을주는 낮은 마름모꼴의 입술 (LRL)를 생성하는 상위 마름모꼴의 입술 (URL)로 세분화 할 수 있습니다. LRL 파생 상품은 청각 와우각 핵의 뉴런과 균형과 모터 제어 5-8를 규제에 관련된 precerebellar 핵 분들을 포함합니다. LRL에서 Neurogenesis은 배아 일 (E) 9.5-16.5 5, 9를 포함 대용량 시간적 창을 통해 발생합니다. 다른 lineages의 연결이 neurogenic 창을 동안 뚜렷한 발달 일간 postmitotic 세포 (또는 태어난다)로 LRL에서 나온다.
유전자 발현 구조의 Electroporation을하는 데 사용할 수있는LRL progenitors의 유전자 발현을 조작하고 잠재적으로이 지역에서 생산된 10-12 뉴런의 운명을 바꿀 수 있습니다. utero의 electroporation의를 통해 마우스의 LRL progenitors의 변화 유전자 발현은 배아 일 E12.5 이상 10, 12-14 일에 태어 lineages 조작을위한 큰 성공을 거두었습니다. utero의 electroporations에는 사전에 E12.5이 주로 인해 성공하지 못했습니다 보여 주죠는 네 번째 뇌실의 roofplate, LRL로 electroporated되는 외인성 DNA를 제공하는 필요한 단계를 펑쳐링과 관련된. 그러나 많은 LRL 파생된 lineages 일찍 E12.5 9보다 LRL에서 발생합니다. 이러한 이전 출생 lineages는 측면 망상을 구성하는 뉴런, 외부 cuneate 및 소뇌 5 척수와 대뇌 피질로부터 입력을 연결하는 기능 precerebellar 시스템의 열등 olivary 핵을 포함합니다. LRL 표현을 조작하기 위해서는E12.5 미만 배아의, 우리는 배아가 electroporation에 따라 문화에 배치되는 체외 시스템에서 개발.
이 연구 E11.5에서 LRL progenitors의 유전자 발현을 조작을위한 효율적이고 효과적인 방법을 제공합니다. 크게 활성 배속 모터에서 구동 녹색 형광 단백질 (GFP)을 electroporated 태아는 reproducibly 문화 24 시간 후 GFP를 표명했다. 이 분석의 핵심 측면은 유전자 발현에만 때문에 외인성 유전자의 표현이 아니라 인해 이차 효과 변경되는 것입니다 electroporation과 culturing 기법에 따른니다. 그것은 내생 유전자 발현 패턴 electroporated과 교양 배아에 그대로 남아있는 것으로 확인되었다. 이 분석은 overexpression에 대한 plasmids의 도입을 통해 E12.5 미만 배아의 LRL에서 신흥 세포의 운명을 변경하거나 (RNAi를 통해) 아래로 노크를 활용할 수 다른 프로신경 전사 요인.
Protocol
Discussion
본 연구에서 제시된 시험 관내 electroporation 기술의 효율적 회임 12 일 이내에 젊은 배아에서 유전자 발현을 조작하는 데 활용할 수있는 새로운 방법입니다. 문화에 대한 태아의 위치는 도입 유전자의 표현을 허용하고 electroporated 배아는 생체내에 남아 허용하는 경우 주죠 지켜 circumvents. 이 기술은 electroporation 기반의 연구 이전에 액세스할 수있었습니다 배아 progenitors에서 유전?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 Math1, Ngn1 위해 제인 존슨 감사 드리고, 그리고 Ptf1a의 항체와 pCAG위한 코니 Cepko :: GFP 플라스미드 것이다. 이 작품은 NIH R15 1R15HD059922-01에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Cryostat | Leica | CM-1850 | |
| Biologie tip Dumoxel treated DUMONT forceps | Fine Scientific Tools | 11252-30 | |
| 20 mm MORIA perforated spoon | Fine Scientific Tools | 10370-17 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation Generator | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* Electrodes | BTX (Fisher) | BTX450165 | |
| Fisher Isotemp CO2 Incubator | Fisher | 1325525 | |
| NAPCO CO2 Gas Regulator | Fisher | 15497020 | |
| 12 Well Tissue Culture Plates | BD Falcon (Fisher) | 877229 | |
| HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); With L-Glutamine and HEPES; 500mL | Thermo Scientific (Fisher) | SH3002301 | |
| HyClone* Donor Equine Serum | Thermo Scientific (Fisher) | SH3007402 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated | Invitrogen | 16140-063 | |
| cellgro* 10,000 IU Penicillin, 10,000μg/mL Streptomycin | Mediatech (Fisher) | MT-30-002-CI | |
| HyClone* L-Glutamine L-Glutamine; 200mM in 0.85% NaCl | Thermo Scientific (Fisher) | SH3003401 | |
| Fast-Green | Fisher | AC41053-0250 | 0.01% |
References
- Ray, R. S., Dymecki, S. M. Rautenlippe Redux — toward a unified view of the precerebellar rhombic lip. Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function. , (1997).
- Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. M. Assembly of the brainstem cochlear nuclear complex is revealed by intersectional and subtractive genetic fate maps. Neuron. 50, 205-218 (2006).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Rodriguez, C. I., Dymecki, S. M. Origin of the precerebellar system. Neuron. 27, 475-486 (2000).
- Taber-Pierce, E. Histogenesis of the nuclei griseum ponitis, corporis pontobulbaris and reticularis tegmenti pontis (bechterew) in mouse. J. Comp. Neurol. 126, 219-240 (1966).
- Dipietrantonio, H. J., Dymecki, S. M. Zic1 levels regulate mossy fiber neuron position and axon laterality choice in the ventral brain stem. Neuroscience. 162, 560-573 (2009).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Taniguchi, H., Kawauchi, D., Nishida, K., Murakami, F. Classic cadherins regulate tangential migration of precerebellar neurons in the caudal hindbrain. Development (Cambridge, England). 133, 1923-1931 (2006).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development (Cambridge, England). 133, 1113-1123 (2006).
- Okada, T., Keino-Masu, K., Masu, M. Migration and nucleogenesis of mouse precerebellar neurons visualized by in utero electroporation of a green fluorescent protein gene. Neuroscience research. 57, 40-49 (2007).
- de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla. Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).
- Landsberg, R. L. Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6. Neuron. 48, 933-947 (2005).
- Hoshino, M. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
- Yamada, M. Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on. Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).
