Oct4GiP Reporter Assay for å studere gener som regulerer Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-fornyelse
Summary
Vi beskriver en fluorescens reporter analyse for å raskt identifisere og karakterisere gener som regulerer mus embryonale stamceller vedlikehold og selvfornyelse.
Abstract
Pluripotency og selvfornyelse er to definerende karakteristikkene av embryonale stamceller (ES-celler). Forstå den underliggende molekylære mekanismen vil i stor grad forenkle bruken av ES celler for utviklingsbiologi studier, sykdom modellering, drug discovery, og regenerativ medisin (anmeldt i 1,2).
For å påskynde identifisering og karakterisering av nye regulatorer av ES celle vedlikehold og selvfornyelse, utviklet vi en fluorescens reporter-baserte analysen til kvantitativt måle selvfornyelse status i mus ES celler ved hjelp av Oct4GiP cellene tre. De Oct4GiP celler uttrykker den grønne fluorescerende protein (GFP) under kontroll av Oct4 genet promoter-regionen 4,5. Oct4 kreves for ES celle selvfornyelse, og er høyt uttrykt i ES cellene og raskt nedregulert i løpet differensiering 6,7. Som et resultat, korrelerer GFP uttrykk og fluorescens i reporteren cellene trofastmed ES cellen identitet 5, og fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) analyse kan brukes til å nøye overvåke selvfornyelse status av cellene på celle-nivå 3,8.
Sammen med RNAi, kan Oct4GiP reporteren analysen brukes til å raskt identifisere og studere regulering av ES celle vedlikehold og selvfornyelse 3,8. Sammenlignet med andre metoder for å analysere selvfornyelse, er det mer praktisk, følsom, kvantitativ, og av lavere kostnader. Det kan utføres i 96 – eller 384-brønnen plater for store studier som high-throughput skjermer eller genetisk epistasis analyse. Til slutt, ved hjelp av andre slektslinje-spesifikke reporter ES cellelinjer, kan analysen vi beskriver her også bli modifisert for å studere skjebnen spesifikasjonen under ES celledifferensiering.
Protocol
Discussion
Den Oct4GiP reporter analysen beskriver vi ovenfor kan kvantitativt måle omfanget av selvfornyelse vs differensiering. Sammenlignet med andre tilgjengelige metoder, for eksempel morfologi-baserte 12 og spredning / levedyktighet-baserte analyser, tilbyr høyere følsomhet og gjennomstrømning, samt en mer direkte måling av ES cellen staten. Det er derfor godt egnet for storskala-skjermer og genetisk epistasis analyse. Faktisk har vi og andre med hell brukt den Oct4GiP reporter analysen for genom-wide RNAi sk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Brad Lackford for lesing og redigering av manuskriptet. Denne forskningen ble støttet av National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health egenutført Research Program Z01ES102745 (til GH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | Millipore | SF001-500P |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | Millipore | DAM1776540 |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 |
| 100x Nucleosides for ES cell | Millipore | 10620-1 |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522-100ml |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 |
Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5′-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon.
References
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Hu, G. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal. Genes Dev. 23, 837-848 (2009).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416, 545-548 (2002).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Nichols, J. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95, 379-391 (1998).
- Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).
- Ding, L. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).
- Chambers, I. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, 643-655 (2003).
- Masui, S. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).
- Mitsui, K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113, 631-642 (2003).
- Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell. 134, 162-174 (2008).
- Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor. 141, 344-352 (1990).
- Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144, 940-954 (2011).
- Chambers, I. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, 1230-1234 (2007).
- Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Rodda, D. J. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).
- Schaniel, C. Delivery of short hairpin RNAs–triggers of gene silencing–into mouse embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).
- Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture. Development. 135, 909-918 (2008).
