Oct4GiP रिपोर्टर परख अध्ययन जीन है कि माउस भ्रूणीय स्टेम सेल रखरखाव और स्व - नवीकरण विनियमन
Summary
हम एक प्रतिदीप्ति परख रिपोर्टर को जल्दी पहचान और जीन है कि माउस भ्रूणीय स्टेम सेल के रखरखाव और आत्म नवीकरण को विनियमित विशेषताएँ वर्णन है.
Abstract
Pluripotency और आत्म नवीकरण भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के दो परिभाषित विशेषताओं (ES कोशिकाओं) कर रहे हैं. अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझना बहुत विकास जीव विज्ञान के अध्ययन, रोग मॉडलिंग, दवाओं की खोज, और पुनर्योजी चिकित्सा 1,2 में समीक्षा के लिए ES कोशिकाओं के उपयोग की सुविधा होगी.
और ES सेल के रखरखाव और आत्म नवीकरण के उपन्यास नियामकों की पहचान और लक्षण वर्णन में तेजी लाने के लिए, हम एक प्रतिदीप्ति संवाददाता आधारित के मात्रात्मक माउस ES Oct4GiP कोशिकाओं 3 का उपयोग कोशिकाओं में आत्म नवीकरण स्थिति को मापने परख विकसित किया है. Oct4GiP कोशिकाओं Oct4 जीन प्रमोटर 4,5 क्षेत्र के नियंत्रण के तहत हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त करते हैं. Oct4 ES सेल आत्म नवीकरण के लिए आवश्यक है, और अत्यधिक ES कोशिकाओं में व्यक्त और 6,7 भेदभाव के दौरान जल्दी से नीचे विनियमित. एक परिणाम के रूप में, GFP और रिपोर्टर कोशिकाओं में अभिव्यक्ति प्रतिदीप्ति ईमानदारी से संबद्धES सेल 5 पहचान, और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के साथ विश्लेषण करने के लिए निकट एकल कक्ष 3,8 स्तर पर कोशिकाओं आत्म नवीकरण की स्थिति पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
आरएनएआई के साथ युग्मित, Oct4GiP संवाददाता परख करने के लिए जल्दी पहचान और ES सेल के रखरखाव और 3,8 आत्म नवीकरण के नियामकों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आत्म नवीकरण परख करने की क्रिया के लिए अन्य तरीकों की तुलना में, यह अधिक सुविधाजनक, संवेदनशील, मात्रात्मक, और कम लागत की है. यह 96 में बाहर ले सकते हैं – या के रूप में उच्च throughput स्क्रीन या आनुवंशिक epistasis विश्लेषण के बड़े पैमाने पर अध्ययन के लिए प्लेट 384 अच्छी तरह से. अंत में, अन्य वंश विशेष संवाददाता ES सेल लाइनों का उपयोग करके, परख हम यहाँ वर्णन भी ES सेल भेदभाव के दौरान भाग्य विनिर्देश का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
Protocol
Discussion
Oct4GiP संवाददाता परख हम ऊपर वर्णन मात्रात्मक आत्म नवीकरण बनाम भेदभाव की हद उपाय कर सकते हैं. आकृति विज्ञान के आधार पर 12 और प्रसार / व्यवहार्यता – आधारित assays के रूप में अन्य उपलब्ध तरीकों की तुलना में, यह उ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पढ़ने और पांडुलिपि संपादन ब्रैड Lackford के लिए धन्यवाद. इस शोध पर्यावरणीय स्वास्थ्य विज्ञान, स्वास्थ्य अंदर का अनुसंधान कार्यक्रम Z01ES102745 के राष्ट्रीय संस्थान (GH) के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | Millipore | SF001-500P |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | Millipore | DAM1776540 |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 |
| 100x Nucleosides for ES cell | Millipore | 10620-1 |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522-100ml |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 |
Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5′-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon.
References
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Hu, G. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal. Genes Dev. 23, 837-848 (2009).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416, 545-548 (2002).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Nichols, J. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95, 379-391 (1998).
- Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).
- Ding, L. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).
- Chambers, I. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, 643-655 (2003).
- Masui, S. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).
- Mitsui, K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113, 631-642 (2003).
- Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell. 134, 162-174 (2008).
- Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor. 141, 344-352 (1990).
- Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144, 940-954 (2011).
- Chambers, I. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, 1230-1234 (2007).
- Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Rodda, D. J. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).
- Schaniel, C. Delivery of short hairpin RNAs–triggers of gene silencing–into mouse embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).
- Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture. Development. 135, 909-918 (2008).
