Den α-test: Rapid Cellefri CD4 Optælling Anvendelse helspyt

Summary

En CD4 tælling metode, α-testen er beskrevet som anvender hele spyt for at tilvejebringe hurtige og nøjagtige CD4 tællinger. De α-test koster øre og eliminerer behovet for teknisk uddannelse, dyre reagenser, såsom monoklonale antistoffer, instrumentering, køleanlæg, transport af prøver samt indsamling og håndtering af blod.

Abstract

Der er et presserende behov for en overkommelig pris CD4 tælling til at overvåge HIV-sygdom. CD4 tælling er uden for rækkevidde i ressource-begrænset områder på grund af den tid og temperatur begrænsninger, teknisk raffinement og omkostninger af reagenser, navnlig monoklonale antistoffer til at måle CD4 på blodceller, den eneste i øjeblikket acceptabel metode. En almindeligt anvendt omkostningsbesparende og tidsbesparende laboratorium strategi er at beregne, snarere end foranstaltninger visse blodværdier. For eksempel LDL-niveauer beregnes ved hjælp af målte niveauer af total cholesterol, HDL og triglycerider ^1. Således identifikation af cellefrie korrelerer der direkte regulere antallet af CD4 ⁺ T-celler kan tilvejebringe en nøjagtig metode til beregning af CD4-tællinger på grund af fysiologiske relevans af korrelerer.

Antallet af stamceller, der træder blod og er bestemt til at blive cirkulerende CD4 ^+-T-celler bestemmes ved chemokin CXCL12 ennd dets receptor CXCR4 på grund af deres indflydelse på bevægelse ^2. Processen stamcelle bevægelse i blodet er yderligere reguleres ved celleoverfladen human leukocytelastase (HLE _CS) og HLE _CS-reaktive aktive α _{1-proteinaseinhibitor} (α _en PI, α _en antitrypsin, SerpinA1) ^3. I HIV-1-sygdom, er α ₁ PI inaktiveret skyldes sygdomsprocesser ^4. I de tidlige asymptomatiske kategorier af HIV-1 sygdom, blev aktivt α _en PI fundet at være under normal i 100% af ubehandlede HIV-1-patienter (median = 12 uM, og for at opnå normale niveauer i de symptomer kategori ^{4, 5.} Denne mønster er blevet tilskrevet immun inaktivering, ikke tilstrækkelig syntese, proteolytisk inaktivering eller iltning. Vi observerede, at HIV-1 individer med> 220 CD4 celler / ul blev CD4 tællinger korreleret med serumniveauer af aktiv α _en PI ^(r2 = 0,93, p &lt, 0,0001, n = 26) og inaktive α _en PI ^(R2 = 0,91, p <0,0001, n = 26) ^5. Indgivelse af α _1-PI til HIV-1 inficerede og uinficerede individer resulterede i dramatiske stigninger i CD4 tællinger antyder α _en PI deltager i reguleringen af antallet af CD4 ⁺ T-celler i blodet ^3.

Ved stimulering indeholder helspyt tilstrækkelig serøs væske (plasma indeholdende proteinholdigt materiale, som passerer gennem blodkarvægge i spyt) for at tillade måling af aktiv α _1-PI og korrelation af denne måling er bevis på, at det er en nøjagtig metode til beregning af CD4 tællinger. Kort fortalt sialogogues såsom tyggegummi eller citronsyre stimulere udsivning af serum i hele munden spyt. Efter stimulering serum exudat, er aktiviteten af serum α _1-PI i spyt målt ved dets evne til at inhibere elastase-aktivitet. Porcin pancreatisk elastase (PPE)er et let tilgængeligt billig kilde af elastase. PPE binder til α _en PI danner en én-til-en kompleks, der forhindrer PV i spalte de specifikke substrater, hvoraf den ene er den kolorimetriske peptidet, succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilid (SA ³ NA). Inkubering spyt med en mættende koncentration af PV i 10 minutter ved stuetemperatur tillader binding af PV til alle aktive α _en PI i spyt. Den resulterende inhibering af PV af aktiv α _en PI kan måles ved at tilsætte PPE substratet SA ³ NA. (Figur 1). Selv CD4 tællinger målt i blodvolumen (CD4 celler / ul), er koncentrationen af α _1-PI i spyt relateret til koncentrationen af serum i spyt, ikke volumen spyt, idet mængden kan variere betydeligt i løbet af dagen og personen til person ^6. Imidlertid næsten hele proteinet i spyt skyldes serum indhold, og proteinindholdet af spyt er MEAsurable ^7. Således er aktiv α _en PI spyt beregnet som et forhold til spyt proteinindhold og betegnes α _en PI Index. Resultaterne præsenteret heri viser, at α _en PI indeks tilvejebringer en nøjagtig og præcis fysiologisk metode til beregning af CD4 tællinger.

Protocol

1. Forbered Friske Working Solutions

1. TBS: 0,05 M Tris-pufret saltopløsning, pH 7,8 (TBS). Fremstille 60 ml TBS / mikrotiterplade.
2. PPE: porcin pancreatisk elastase, type 1 (PPE) er tilvejebragt som en suspension. Ryst godt og fortyndes PV i TBS til ca 0,01 U / ml. Fremstilling af 6 ml arbejdsopløsning / mikrotiterplade).
3. SA ³ NA: succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilid (SA ³ NA). Fremstille 0,1 M stamopløsning SA ³ NA opløsning i dimethylsulfoxid (DMSO) og anvendes straks eller opbevares ved -20 ° C. Fremstille 6ml arbejdsopløsning / mikrotiterplade ved fortynding bestand SA ³ NA opløsning 1/100 i TBS.
4. Coomassie Blue: Der fremstilles en stamopløsning af 10% Coomassie Brilliant Blue R-250 (Coomassie Blue) i TBS og anvendes straks eller opbevares ved -20 ° C. Fremstilling af 6 ml arbejdsopløsning ved at fortynde stamopløsningen 1/1000 i TBS.

2. Forbered Spyt

Spyt Collection: i stående stilling, serum udsondring stimulere i spyt ved at placere et sialagogum såsom citronsyre eller tyggegummi i munden. A-sukker-fri citron drop er bekvemt for HIV-1 patienter, som ofte er tandløse og ude af stand til at tygge tyggegummi. Swallow som er nødvendig for de første 3 min, og samle hele munden spyt til en udjævnet kop for de næste 3 min. Dette vil give cirka 2 ml af spyt. Anvendes straks eller opbevares ved -80 ° C.

SPYT HÅNDTERING: Hvis produktet er frosset, optø prøven ved 37 ° C og anbring på is. Lagring frisk eller optøet prøven ved 2-4 ° C ikke mere end 3 dage. Undlad at slynge spyt og undgå pipettering mucin, der ikke indeholder serum ekssudat. Brug Standard Forholdsregler ved håndtering spyt http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf .

3. Mikrotiterplade Set-up

2. Enheder: Til hver brønd sættes 20 ul spyt for et slutvolumen på 150 gl / brønd. Blandes ved pipettering uden at indføre bobler.
3. KONTROL: Den positive kontrol indeholder PPE, men ingen spyt. Den negative kontrol indeholder spyt, men ingen PPE.To den positive kontrol brønd tilsættes 20 uL TBS. Til den negative kontrol brønd tilsættes 20 uL spyt.
4. PPE inkubation: Ryst PPE arbejdsopløsning godt. Tilsættes 50 uL PPE bearbejdning opløsning til hver brønd med undtagelse af de negative kontrolbrønde. De negative kontrolbrønde, 50 pi TBS tilsættes. Inkuber 10 min ved 23 ° C.
5. Substratinkubation: Tilsæt 50 ul SA ³ NA arbejder opløsning til hver brønd. Inkuber 45 min ved 23 ° C.
6. Coomassie Blue. Tilsæt 50 uL Coomassie Blue arbejdsopløsning </ Li>
7. Udlæsning: Læs absorbans i mikropladelæser, A _{405 nm} for at påvise SA ³ NA spaltning som repræsenterer aktive α _en PI og en _{595 nm} for at påvise Coomassie Blue som repræsenterer proteinindhold.

4. Beregn α _en PI Index

1. Normalisere GENNEMSNITLIGE A _{405 nm} og en _{595 nm:} For hver tre eksemplarer, den gennemsnitlige beregne. Træk den negative kontrol gennemsnit fra prøven gennemsnittet. For at minimere plade-til-plade variation, normalisere gennemsnit ved at dividere hver prøve gennemsnit af den positive kontrol gennemsnit som følger:
   

2. BEREGN DET α ₁ PI INEX: Del normaliserede A _{405 nm} af de normaliserede A _{595 nm:}
   

5. Repræsentative resultater

For at afgøre, om α-testen måske være egnet til brug som en point-of-care screening test til kontrol CD4-tællinger i endemiske, ressource-begrænsede områder, blev stimuleret spyt indsamlet fra 20 kvindelige og 11 mandlige HIV-1 forsøgspersoner deltage klinik for rutinemæssige pleje i Cameroun. Overensstemmelse med indledende iagttagelser under udviklingen af α-testen med spyt opsamlet i New York City, α _en PI-indeks i spyt opsamlet i Cameroun korreleret med CD4 tællinger ^(R2 = 0,91, p <0,0001. N = 31). Forholdet blev defineret ved en 3-parameter sigmoidal kurve, som er konsistent med en dosis-respons-forhold (Figur 2A). 95% tillid og forudsigelse intervaller er afbildet med blå og røde linjer, henholdsvis (Figur 2B).

Ien tidligere undersøgelse har vi konstateret, at CD4 ⁺ T-celler udviser sinusformet cykling med periodicitet 23 ± 3,5 dage i HIV-1 individer og hos patienter med arvelig version af α _en PI-deficiens (Pizz) ^3. Afbildet heri er et repræsentativt eksempel på computer-genereret sinuskurve analyse af CD4 cykler i en ikke-HIV-1 sund kontrol udviser 27 dage periodicitet (figur 3A).

Computergenereret sinuskurve analyse af CD4 ^{+-T-celle-ændringer} i 6 forsøgspersoner viste værdier for spids-til-spids-amplitude og aksen af oscillation ^3. Som det ville forventes, blev akse af oscillationen korrelerede med amplitude ^(r2 = 0,96, p = 0,009, n = 6) (figur 3B). Hos patienter vil lave CD4 T ^+-celletal, de cykliske ændringer i CD4 T-celletal var lille, og i patienter med høje CD4 ^+-T-celletal var cykliske ændringer store.

Fordiregressionslinje afbildet i figur 2 anslår aksen af oscillation og aksen af oscillationen er korreleret med amplitude, amplitude kan beregnes for regressionslinjen derved estimere, hvor langt over og under regressionslinjen CD4 ⁺ T-celler vil forventes at variere på grund af cykling (figur 3C). Overlejring af den amplitude beregnes i figur 3C og konfidensintervallet beregnet i figur 2B, blev det konstateret, at amplituden (grøn linje) ligger inden for 95% konfidensintervallet (blå linie) (figur 3D).

Figur 1. Procedure Resumé: Place citronsyre i munden og indsamle spyt. Tilsættes fortyndet spyt til brønde i en mikroplade in triplo. Tilsættes PV til hver brønd og inkuberes i 15 minutter ved 23 ° C. Tilsættes PPE substrat til hver brønd og inkuberes i 45 minutter ved 23 ° C. Tilsættes Coomassie Blue og aflæst ved 405 nm for at påvise PPE aktivitet og ved 595 nm for at påvise protein.

Figur 2. Sammenligning af α-test med standard CD4 tælling metode. A) α-test blev udført ved at kvantificere α _en PI-indeks i stimulerede hele munden spyt. CD4 tællinger blev udført ved en uafhængigt medicinsk laboratorium ved anvendelse af standard flowcytometri. Blod til flowcytometri og spyt blev opsamlet på samme klinikbesøg. Forholdet mellem α _en PI-indeks og CD4-tællinger blev defineret ved en 3-parameter sigmoidal kurve ^(r2 = 0,91, p <0,0001, n = 31). B) 95% og forudsigelse intervaller er afbildet i blåt og rødt linier, henholdsvis.

Figur 3. Nøjagtighed beregning af CD4 counts anvender α1PI Index.A) CD4 ⁺ T-celler udviste sinusformet cykling med 27 dage periodicitet i en ikke-HIV-1 sund kontrol. Aksen af oscillationen er afbildet (rød stiplet linie). B) Computer genereres sinusbølge analyse af CD4 T-celle cykling blev anvendt til at beregne spids-til-spids-amplitude og aksen af oscillation i 4 HIV-1 fag, 1 non-HIV -1 Pizz emne, og det ikke-HIV-1 sund kontrol er vist i del A. Forholdet mellem CD4 T ^+-celle amplitude og aksen af oscillation blev defineret ved 3-parameter sigmoidal kurve ^(r2 = 0,96, p = 0,009, n = 6). C) sigmoidal Forholdet mellem amplitude-og aksen af oscillation er afledt i del B) blev anvendt til at beregne den forventede amplitude (grønne linier) af punkter langs regressionslinie (sort linje) fra fig. 2. D) Den forventede amplitude interval (grønne linier) var signifikant forskellig fra 95% konfidensinterval (blå linjer), som fastlagt af Mann Whitney Rank Sum Test (baseret på en sammenligning af medianen forskellen mellem 95% konfidensinterval og regressionslinien (63 celler / ul) og median forskel mellem amplituden linje og regressionslinien (37 celler / ul), p = 0,001).

Discussion

Ufortyndet serum indeholder median 36 uM α _en PI og 3,6 uM α _{2-makroglobulin} (α ₂ M) en 10-fold forskel ^8. Begge proteiner konkurrerer om binding til PV. Disse to egenskaber, koncentration og PV affinitet, er blevet udnyttet til at udvikle en fremgangsmåde, der er i stand til specifikt at måle α _en PI i normalt serum i nærvær af konkurrerende α ₂ M ^8. Denne fremgangsmåde kan påvise så lidt som 50 nM μ _1-PI i 0,3% serum. Ved en serumfortynding på 2,5%, bliver binding af α ₂ M til PPE målbart, og denne fortynding indeholder ca 900 nM α _en PI og 90 nM α ₂ M.

I modsætning til serum, som er sammensat af 10-fold mere α _en PI end α ₂ M, hele munden spyt indeholder en 20-fold forskel ^9. Fandt vi i den foreliggende undersøgelse at ufortyndet, stimulerede spytindeholder cirka 30 gange mindre α _en PI end serum eller ca 1200 nM α _en PI og ville forventes at indeholde cirka 60 nM α ₂ M. Den optimale spyt fortynding for α-test blev fundet at være 13% stimuleret spyt, og denne fortynding ville forventes at indeholde cirka 160 nM α _en PI og 8 nM α ₂ M, en koncentration af α ₂ M, som er under tærsklen af detektering i protokollen. På grund af den lave koncentration af α ₂ M, er det muligt nøjagtigt at bestemme den specifikke aktivitet af α _1-PI i spyt uden bekymring for konkurrence fra α ₂ M. Målinger af aktiv α _en PI og proteinindholdet i spyt tillod beregning af α _en PI Index, der viste sig at korrelere med standardmetode til måling CD4 tællinger, flowcytometri. Vigtigere er resultaterne af regressionsanalyse (r

CD4-tælling metoder har ikke tidligere taget hensyn til den variation, der skyldes cykling. I praksis kan CD4-tællinger variere med så meget som 200 celler / mikroliter mellem nadir og toppunkt med en hyppighed på 23-27 dage, og dette gælder uanset hvilken metode til måling af CD4 ⁺ T-celler ^3. Således sinusbølge akse oscillation giver en mere nøjagtig måling af en persons sande CD4 ⁺ T-celletal end en enkelt dags foranstaltning, fordi akse oscillation er konstant time til time, uge til uge. Selv om det ikke være muligt direkte at måle akse af oscillationen af et individs CD4 ⁺ T-celler, kan dette skønnes ved hjælp af et gennemsnit af langsgående CD4 ^+-T-celletal så længe variationen i CD4 tællinger ikke overstiger den forventede amplitude. Stor variations i CD4-tal ville indikere påvirkning af andre variabler end cykling.

Regressionslinjen afbildet i figur 2 er et estimat af aksen af oscillation. Beregning af den forventede amplitude over og under regressionslinjen viste, at amplituden ligger inden for 95% konfidensinterval. Medianen Forskellen mellem 95% konfidensinterval og regressionslinje er 63 CD4 celler / ul, og median forskellen mellem amplituden og regressionslinje er 37 CD4 celler / ul. Dette kan fortolkes således, at 95% af de CD4-tællinger beregnes ud fra α-test målinger vil være inden for ca 63 CD4 celler / mikroliter fra de faktiske CD4-tal, og at ca 58% af denne forskel skyldes CD4 cykling. Således præcision α-testen er afstanden mellem konfidensinterval og amplitude, som er cirka 26 CD4 celler / ul, og nøjagtigheden af ​​α-testen er korrelationen coefficient af regressionslinjen, der er 0,95 eller 95%.

Der er adskillige begrænsninger for α-testen som beskrevet heri, men løsninger er let tilgængelige. For eksempel beskrev α-testen selvom anvender en mikrotiterplade format, evnen til at udføre α-testen under anvendelse af en enkelt spyt fortynding giver α-testen, der skal anvendes med dipstick teknologi, en middel-fri, teknologisk enkelt system. Ca. 2% af spytprøver opsamlet i Cameroun var for viskøs til at manipulere, og dette er i overensstemmelse med spyt opsamlet i New York. Anvendelsen af DNase til sådanne prøver kan anvendes til at lindre viskositeten og derved tillade måling ^10. En yderligere løsning kunne være at bruge farmakologiske sialagogues, der specifikt stimulerer spytsekretionen via det parasympatiske versus sympatiske vej derved at fremstille våde spyt. En sådan sialagogue er pilocarpin ^11. Endelig α-testen ikket endnu ikke er valideret, og dette er nødvendigt for at afgøre, om ydeevnen er tilstrækkeligt diskriminerende for kritiske niveauer af CD4 tal ^12.

De kritiske niveauer for CD4 tællinger er i det lineære område af sigmoidal regressionskurven som tillod disse værdier beregnes ved en lineær algoritme. I denne population af lineære regression for værdier <860 CD4 celler / ul ^(r2 = 0,86, n = 30, p ^<2x10-7) var lige så god som sigmoidal regression ^(r2 = 0,88, n = 30, p < 0,0001). Den lineære regression af _a1 PI indeks over 67, hvilket svarer til omkring 350 CD4 celler / ul _(R2 = 0,88, n = 15, p = 0,002) var lige så god som sigmoidal regression ^(r2 = 0,89, n = 15, p <0,0001). Imidlertid korrelation var ikke signifikant ved _a1 PI indeks under 67, som svarede til <350 CD4 celler / ul ^(r2 = 0,17, p = 0,54, n = 15). Dette er en kritisk værdi, idet WHO retningslinjer anbefaler et CD4-tal <350 CD4-celler / mikroliter for at kvalificere sig til adgang til antiretroviral behandling ^13. Bedre bestemme ydeevnen af ​​α-test og forbedre følsomheden ved lavere værdier, der yderligere 800 spytprøver blev opsamlet i Cameroon fra 4 grupper: nyfødte-2 yrs, 3-5 yrs og 6-15 yrs og 16 år og ældre.

Som konklusion er den α-test fysiologisk relevant til antallet af CD4-celler i blodet alligevel kan udføres under anvendelse af spyt hvorved der tilvejebringes en ikke-invasiv, nøjagtige og præcise point-of-care fremgangsmåde til overvågning af CD4 tællingerne i endemiske områder uden instrumentering ved en cost-per-test, som er mindre end en dollar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sialogogue, 0.05M citric acid	Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144	Sugar-Free Lemon dropS
Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103	E1250
Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760
Coomassie Brilliant Blue R-250	Sigma-Aldrich	B7920
Tissue culture-treated, 96 well microplates	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886	35-3072
Microplate Reader with filters for 405nm and 595nm	MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182	Dynex P97277