Den α-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Bruke Hele Spytt

Summary

En CD4 oppregning metoden, α-test, er beskrevet som bruker hele spytt for å gi raske og nøyaktige CD4-tall. De α-test koster pennies og eliminerer behovet for teknisk opplæring, kostbare reagenser som monoklonale antistoffer, instrumentering, kjøling, transport av prøver, samt innsamling og håndtering av blod.

Abstract

Det er et presserende behov for rimelig CD4 telling å overvåke HIV sykdom. CD4 Oppregningen er utilgjengelig i ressurs-begrensede områder på grunn av tid og temperatur restriksjoner, teknisk raffinement, og kostnader av reagenser, særlig monoklonale antistoffer til måle CD4 på blodceller, det eneste øyeblikket akseptabel metode. En vanlig brukt kostnadsbesparende og tidsbesparende laboratorium strategi er å beregne, fremfor å måle visse blodverdier. For eksempel er LDL-nivå beregnet ved hjelp av målte nivåene av total kolesterol, HDL og triglyserider ^en. Dermed teller identifisering av celle-frie korrelater som direkte regulerer antallet CD4 ⁺ T celler kan gi en nøyaktig metode for beregning CD4 grunn av fysiologiske relevans korrelater.

Antall stamceller som angir blod og er skjebnebestemt til å bli sirkulerende CD4 ⁺ T celler bestemmes av chemokine CXCL12 ennd sin reseptor CXCR4 grunn av sin innflytelse på locomotion ^to. Prosessen med stamcelle bevegelse inn i blodet er i tillegg regulert av celleoverflaten human leukocytt elastase (hle _CS) og hle _CS-reaktivt aktive α ₁ proteinase inhibitor (α ₁ PI, _en α antitrypsin, SerpinA1) ^3. I HIV-1 sykdom, er α _en PI inaktivert på grunn av sykdom prosesser ^4. I de tidlige asymptomatiske kategorier av HIV-1 sykdom, ble aktiv α ₁ PI funnet å være under normal i 100% av ubehandlede HIV-1 pasienter (median = 12 mM, til og oppnå normale nivåer i løpet av de symptomatiske kategoriene ^{4, 5.} Dette mønsteret har blitt tilskrevet immune inaktivering, ikke for lite syntese, proteolytisk inaktivering, eller oksygenering. Vi observerte at i HIV-1 fag med> 220 CD4-celler / mL ble CD4-tall korrelert med serumnivået av aktive α _en PI (r ² = 0,93, p &lt; 0,0001, n = 26) og inaktive α _en PI (r ² = 0,91, p <0,0001, n = 26) ^5. Administrasjon av α ₁ PI til HIV-1 infiserte og ikke-infiserte pasienter resulterte i dramatiske økninger i CD4-tall tyder på α ₁ PI deltar i regulering av antallet CD4 ⁺ T celler i blodet ^tre.

Med stimulering, inneholder hele spytt nok serøs sekresjon (plasma inneholder proteinavleiring materiale som passerer gjennom blodårene vegger i spytt) for å tillate måling av aktive α ₁ PI og korrelasjonen av denne målingen er bevis på at det er en nøyaktig metode for beregning CD4-tall. Kort, sialogogues som tyggegummi eller sitronsyre stimulere exudation av serum i hele munnen spytt. Etter å stimulere serum exudation, er aktiviteten av serum α ₁ PI i spytt målt ved sin evne til å hemme elastase aktivitet. Svin bukspyttkjertelen elastase (PPE)er en lett tilgjengelig billig kilde til elastase. PPE binder seg til α ₁ PI danner en en-til-en kompleks som hindrer PVU fra spalte sine spesifikke substrater, hvorav den ene er den kolorimetrisk peptid, succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA ³ NA). Ruger spytt med en mette konsentrasjon av PVU i 10 min ved romtemperatur tillater binding av PVU til alle aktive α ₁ PI i spytt. Den resulterende hemming av PVU ved aktiv α ₁ PI kan måles ved å legge PVU underlaget SA ³ NA. (Figur 1). Selv CD4-tall er målt i blod volum (CD4 celler / mL), er konsentrasjonen av α ₁ PI i spytt knyttet til konsentrasjonen av serum i spytt, ikke til volum av spytt siden volum kan variere betydelig i løpet av dagen og person til person ^seks. Imidlertid er nesten alt proteinet i spytt på grunn av serum innhold, og proteininnholdet i spytt er measurable ^7. Dermed er aktive α ₁ PI i spytt beregnes som forholdet til spytt proteininnhold og den såkalte α ₁ PI Index. Resultater som presenteres her viser at α ₁ PI Index gir en nøyaktig og presis fysiologisk metode for beregning av CD4-tall.

Protocol

1. Forbered Ferske Working Solutions TBS: 0,05 M Tris saltløsning, pH 7,8 (TBS). Forbered 60 ml TBS / mikroplate. PPE: porcine bukspyttkjertelen elastase, type 1 (PPE) er gitt som en suspensjon. Rist godt og fortynne PPE i TBS til ca 0,01 U / ml. Forbered 6 ml arbeidsløsning / mikroplate). SA 3 NA: succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA 3 NA). Forbered 0,1 M lager SA 3 NA løsning i dimethyl sulfox…

Discussion

Ufortynnet serum inneholder median 36 mM α ₁ PI og 3,6 mM α ₂ makroglobulin (α ₂ M) en 10-fold forskjell ^8. Begge proteiner konkurrere om binding til PPE. Disse to egenskapene, konsentrasjon og PPE tilhørighet, har blitt utnyttet for å utvikle en metode som er i stand til spesifikt måle α ₁ PI i normal serum i nærvær av konkurrerende α ₂ M ^8. Denne metoden kan påvise så lite som 50 nm μ ₁ PI i 0,3% serum. På en serumfor…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Sialogogue, 0.05M citric acid	Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144	Sugar-Free Lemon dropS
Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103	E1250
Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760
Coomassie Brilliant Blue R-250	Sigma-Aldrich	B7920
Tissue culture-treated, 96 well microplates	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886	35-3072
Microplate Reader with filters for 405 nm and 595 nm	MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182	Dynex P97277