Summary
En CD4 oppregning metoden, α-test, er beskrevet som bruker hele spytt for å gi raske og nøyaktige CD4-tall. De α-test koster pennies og eliminerer behovet for teknisk opplæring, kostbare reagenser som monoklonale antistoffer, instrumentering, kjøling, transport av prøver, samt innsamling og håndtering av blod.
Abstract
Det er et presserende behov for rimelig CD4 telling å overvåke HIV sykdom. CD4 Oppregningen er utilgjengelig i ressurs-begrensede områder på grunn av tid og temperatur restriksjoner, teknisk raffinement, og kostnader av reagenser, særlig monoklonale antistoffer til måle CD4 på blodceller, det eneste øyeblikket akseptabel metode. En vanlig brukt kostnadsbesparende og tidsbesparende laboratorium strategi er å beregne, fremfor å måle visse blodverdier. For eksempel er LDL-nivå beregnet ved hjelp av målte nivåene av total kolesterol, HDL og triglyserider en. Dermed teller identifisering av celle-frie korrelater som direkte regulerer antallet CD4 + T celler kan gi en nøyaktig metode for beregning CD4 grunn av fysiologiske relevans korrelater.
Antall stamceller som angir blod og er skjebnebestemt til å bli sirkulerende CD4 + T celler bestemmes av chemokine CXCL12 ennd sin reseptor CXCR4 grunn av sin innflytelse på locomotion to. Prosessen med stamcelle bevegelse inn i blodet er i tillegg regulert av celleoverflaten human leukocytt elastase (hle CS) og hle CS-reaktivt aktive α 1 proteinase inhibitor (α 1 PI, en α antitrypsin, SerpinA1) 3. I HIV-1 sykdom, er α en PI inaktivert på grunn av sykdom prosesser 4. I de tidlige asymptomatiske kategorier av HIV-1 sykdom, ble aktiv α 1 PI funnet å være under normal i 100% av ubehandlede HIV-1 pasienter (median = 12 mM, til og oppnå normale nivåer i løpet av de symptomatiske kategoriene 4, 5. Dette mønsteret har blitt tilskrevet immune inaktivering, ikke for lite syntese, proteolytisk inaktivering, eller oksygenering. Vi observerte at i HIV-1 fag med> 220 CD4-celler / mL ble CD4-tall korrelert med serumnivået av aktive α en PI (r 2 = 0,93, p < 0,0001, n = 26) og inaktive α en PI (r 2 = 0,91, p <0,0001, n = 26) 5. Administrasjon av α 1 PI til HIV-1 infiserte og ikke-infiserte pasienter resulterte i dramatiske økninger i CD4-tall tyder på α 1 PI deltar i regulering av antallet CD4 + T celler i blodet tre.
Med stimulering, inneholder hele spytt nok serøs sekresjon (plasma inneholder proteinavleiring materiale som passerer gjennom blodårene vegger i spytt) for å tillate måling av aktive α 1 PI og korrelasjonen av denne målingen er bevis på at det er en nøyaktig metode for beregning CD4-tall. Kort, sialogogues som tyggegummi eller sitronsyre stimulere exudation av serum i hele munnen spytt. Etter å stimulere serum exudation, er aktiviteten av serum α 1 PI i spytt målt ved sin evne til å hemme elastase aktivitet. Svin bukspyttkjertelen elastase (PPE)er en lett tilgjengelig billig kilde til elastase. PPE binder seg til α 1 PI danner en en-til-en kompleks som hindrer PVU fra spalte sine spesifikke substrater, hvorav den ene er den kolorimetrisk peptid, succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA 3 NA). Ruger spytt med en mette konsentrasjon av PVU i 10 min ved romtemperatur tillater binding av PVU til alle aktive α 1 PI i spytt. Den resulterende hemming av PVU ved aktiv α 1 PI kan måles ved å legge PVU underlaget SA 3 NA. (Figur 1). Selv CD4-tall er målt i blod volum (CD4 celler / mL), er konsentrasjonen av α 1 PI i spytt knyttet til konsentrasjonen av serum i spytt, ikke til volum av spytt siden volum kan variere betydelig i løpet av dagen og person til person seks. Imidlertid er nesten alt proteinet i spytt på grunn av serum innhold, og proteininnholdet i spytt er measurable 7. Dermed er aktive α 1 PI i spytt beregnes som forholdet til spytt proteininnhold og den såkalte α 1 PI Index. Resultater som presenteres her viser at α 1 PI Index gir en nøyaktig og presis fysiologisk metode for beregning av CD4-tall.
Protocol
1. Forbered Ferske Working Solutions
- TBS: 0,05 M Tris saltløsning, pH 7,8 (TBS). Forbered 60 ml TBS / mikroplate.
- PPE: porcine bukspyttkjertelen elastase, type 1 (PPE) er gitt som en suspensjon. Rist godt og fortynne PPE i TBS til ca 0,01 U / ml. Forbered 6 ml arbeidsløsning / mikroplate).
- SA 3 NA: succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA 3 NA). Forbered 0,1 M lager SA 3 NA løsning i dimethyl sulfoxide (DMSO) og bruk straks eller oppbevar ved -20 ° C. Forbered 6ml arbeidsløsning / mikroplate ved å fortynne lager SA 3 NA løsning 1/100 i TBS.
- Coomassie BLUE: Forbered en stamløsning på 10% Coomassie Brilliant Blue R-250 (Coomassie Blue) i TBS og bruke umiddelbart eller lagre ved -20 ° C. Forbered 6 ml arbeidsløsning ved fortynning stamløsning 1/1000 i TBS.
2. Forbered Spytt
3. Mikroplate Set-up
- PRØVER: Til hver testbrønn, legges 20 mL spytt for en endelig volum på 150 mL / brønn. Bland ved pipettering uten å innføre bobler.
- KONTROLLER: Den positive kontrollen inneholder PPE, men ingen spytt. Den negative kontrollen inneholder spytt, men ingen PPE.To positiv kontroll brønnen er lagt 20 mL TBS. Til den negative kontrollen brønnen er lagt 20 mL spytt.
- PPE Inkubasjon: Rist PPE arbeidsløsning godt. Tilsett 50 mL PPE arbeider løsning til hver brønn unntatt den negative kontrollen brønnene. Til negativ kontroll brønnene, tilsett 50 mL TBS. Inkuber 10 min ved 23 ° C.
- UNDERLAG Inkubasjon: Tilsett 50 mL SA 3 NA arbeider løsning til hver brønn. Inkuber 45 min ved 23 ° C.
- Coomassie BLUE:. Tilsett 50 mL Coomassie Blå arbeidsløsning </ Li>
- LES-OUT: Les absorbans i mikroplateleser, A 405 nm å oppdage SA 3 NA cleavage som representerer aktive α 1 PI og A 595 nm å oppdage Coomassie Blå som representerer proteininnhold.
4. Beregn α 1 PI Index
- Normaliser gjennomsnitt en 405 nm og en 595 nm: For hver triplikat beregne gjennomsnittlig. Trekk den negativ kontroll gjennomsnittet fra prøven gjennomsnittet. For å minimere plate-til-plate variasjon, normalisere gjennomsnittet ved å dele hver prøve gjennomsnitt ved Positiv kontroll gjennomsnitt som følger:
- Beregn α 1 PI INEX: Del den normaliserte en 405 nm av normaliserte A 595 nm:
5. Representative Resultater
Å avgjøre om α-test kan være egnet for bruk som en point-of-care screening test for å overvåke CD4-tall i endemisk, ressurs-begrensede områder, ble stimulert spytt samlet fra 20 kvinnelige og 11 mannlige HIV-1 fag deltar klinikk for rutinemessig omsorg i Kamerun. I samsvar med foreløpige observasjoner under utviklingen av α-testen med spytt samles i New York City, α 1 PI Index i spytt samles i Kamerun korrelert med CD4-tall (r 2 = 0,91, p <0,0001. N = 31). Forholdet ble definert av en tre-parameter sigmoidal kurve som er konsistent med en dose-respons-forholdet (Figur 2A). Den 95% sikkerhet og prediksjon intervaller er avbildet med blå og røde linjer, henholdsvis (figur 2B).
Ien tidligere studie, fant vi ut at CD4 + T celler stiller sinusformet sykling med periodisitet 23 ± 3,5 dager i HIV-1 fag og i fag med den nedarvede versjon av α 1 PI mangel (Pizz) 3. Avbildet her er et representativt eksempel på datagenerert sinus kurve analyse av CD4 sykling i en ikke-HIV-1 sunn kontroll viser 27 dagers periodisitet (figur 3A).
Computer genererte sinus kurve analyse av CD4 + T celleforandringer i 6 fag gitt verdier for topp-til-peak amplitude og aksen for pendling tre. Som forventet, var aksen for pendling korrelert med amplitude (r 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6) (Figur 3B). Hos pasienter vil lave CD4 T + celletall, de sykliske endringene i CD4 T celletall var små, og hos pasienter med høye CD4 + T celletall, sykliske endringer var store.
Fordiregresjonslinjen avbildet i figur 2 anslår aksen for pendling og aksen for pendling er korrelert med amplitude, amplitude kan beregnes for regresjonslinjen og dermed beregne hvor langt over og under regresjonslinjen CD4 + T celler kan forventes å variere på grunn sykling (Figur 3C). Overliggende amplituden beregnet i figur 3C og konfidensintervallet beregnet i figur 2B, ble det funnet at amplitude (grønn linje) ligger innenfor 95% konfidensintervall (blå linje) (Figur 3D).
Figur 1. Prosedyre Oppsummering: Plasser sitronsyre i munnen og samle spytt. Legg utvannet spytt til brønner på en mikroplate i tre eksemplarer. Legg PPE til hver brønn og inkuberes i 15 minutter ved 23 ° C. Legg til PPE underlaget til hver brønn og inkuberes i 45 minutter ved 23 ° C. Legg Coomassie Blå og lese ved 405 nm å oppdage PPE aktivitet og ved 595 nm å oppdage protein.
Figur 2. Sammenligning av α-test med standard CD4 telling metoden. A) Den α-testen ble utført av quantitating den α 1 PI Index i stimulert hele munnen spytt. CD4-tall ble utført av en uavhengig medisinsk laboratorium med standard flowcytometri. Blood for flowcytometri og spytt ble samlet ved samme klinikken besøk. Forholdet mellom α 1 PI Index og CD4-tall ble definert av en tre-parameter sigmoidal kurve (r 2 = 0,91, p <0,0001, n = 31). B) 95% konfidensintervall og prediksjon intervaller er avbildet i blått og rødt linjer, henholdsvis.
Figur 3. Nøyaktighet for beregning av CD4 counts bruker α1PI Index.A) CD4 + T celler utstilt sinusformet sykling med 27 dagers periodisitet i en ikke-HIV-1 sunn kontroll. Aksen for pendling er avbildet (rød stiplet linje). B) Datamaskin generert sinusbølge analyse av CD4 T-celle sykling ble brukt til å beregne topp-til-peak amplitude og aksen for pendling i 4 HIV-1 fag, 1 non-HIV -1 Pizz emne, og den ikke-HIV-1 sunn kontroll avbildet i del A. Forholdet mellom CD4 T + celle amplitude og aksen for pendling ble definert av tre-parameter sigmoidal kurve (r 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6). C) sigmoidal Forholdet mellom amplitude og aksen for pendling stammer delvis B) ble brukt for å beregne forventet amplitude (grønne linjer) av punkter langs regresjonslinjen (sort linje) fra Figur 2. D) Den forventede amplitude intervall (grønne linjer) var signifikant forskjellig fra 95% konfidensintervall (blå linjer) som bestemmes av Mann Whitney Rank Sum Test (basert på en sammenligning av median differansen mellom 95% konfidensintervall og regresjonslinjen (63 celler / mL) og median forskjell mellom amplituden linje og regresjonslinjen (37 celler / mL), p = 0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ufortynnet serum inneholder median 36 mM α 1 PI og 3,6 mM α 2 makroglobulin (α 2 M) en 10-fold forskjell 8. Begge proteiner konkurrere om binding til PPE. Disse to egenskapene, konsentrasjon og PPE tilhørighet, har blitt utnyttet for å utvikle en metode som er i stand til spesifikt måle α 1 PI i normal serum i nærvær av konkurrerende α 2 M 8. Denne metoden kan påvise så lite som 50 nm μ 1 PI i 0,3% serum. På en serumfortynning på 2,5%, blir bindende for α 2 M til PPE umulig å oppdage, og dette fortynning inneholder cirka 900 nM α 1 PI og 90 nM α 2 M.
I motsetning til serum som består av 10 ganger mer α 1 PI enn α 2 M, hele munnen spytt inneholder et 20-fold forskjell ni. Vi fant i denne studien at ufortynnet, stimulert spyttinneholder omtrent 30 ganger mindre α 1 PI enn serum eller ca 1200 nM α 1 PI og forventes å inneholde ca 60 nM α 2 M. Den optimale spytt fortynning for α-testen ble funnet å være 13% stimulert spytt, og dette fortynning forventes å inneholde ca 160 nM α 1 PI og 8 nM α 2 M, en konsentrasjon av α 2 M som er under terskelen for påvisning i protokollen. På grunn av den lave konsentrasjonen av α 2 M, er det mulig å nøyaktig fastslå den spesifikke aktiviteten av α 1 PI i spytt uten bekymring for konkurranse fra α 2 M. Målinger av aktive α 1 PI og proteininnhold i spytt tillatt beregningen av α 1 PI Index, som ble funnet å korrelere med standard metode for måling av CD4-tall og flowcytometri. Viktigere, resultatene av regresjonsanalysen (r CD4 Bestemmelse metoder har ikke tidligere tatt hensyn til variasjonen som skyldes sykling. I praksis kan CD4-tall variere med så mye som 200 celler / mL mellom nadir og apex med en periodisitet på 23-27 dager, og dette gjelder uavhengig av metode for måling av CD4 + T celler 3. Dermed gir den sinusbølge aksen for pendling en mer nøyaktig mål på en persons virkelige CD4 + T celletall enn en enkelt dag bruker for å måle fordi aksen for pendling er konstant time til time, uke til uke. Selv om det kanskje ikke være mulig å direkte måle aksen for pendling for en persons CD4 + T celler, kan dette estimeres ved hjelp av et gjennomsnitt av langsgående CD4 + T celletall så lenge variasjon i CD4-tall ikke overstiger den forventede amplitude. Stor variasjons i CD4-tall indikerer påvirkning av variabler enn sykling. Regresjonslinjen avbildet i Figur 2 er et anslag på aksen for pendling. Beregning av forventet amplitude over og under regresjonslinjen viste at amplitude ligger innenfor 95% konfidensintervall. Medianen Forskjellen mellom 95% konfidensintervall og regresjonslinjen er 63 CD4 celler / mL, og median forskjell mellom amplitude og regresjonslinjen er 37 CD4 celler / mL. Dette kan tolkes til å bety at 95% av CD4-tall beregnet fra α-test målingene vil være innen ca 63 CD4 celler / mL fra de faktiske CD4-tall og at ca 58% av denne forskjellen vil skyldes CD4 sykling. Dermed er presisjonen i α-test avstanden mellom konfidensintervallet og amplitude som er omtrent 26 CD4 celler / mL, og nøyaktigheten av α-test er korrelasjonen coefficient av regresjonslinjen som er 0,95 eller 95%. Det er flere begrensninger til α-test som beskrevet her, men løsningene er lett tilgjengelig. For eksempel, selv om α-testen beskrevet bruker en mikroplate format, gjør at evnen til å utføre α-test ved hjelp av en enkelt spytt fortynning av α-test for å brukes med peilestaven teknologi, et instrument-fri, teknologisk enkle systemet. Omtrent 2% av spytt prøver samlet i Kamerun var for seigt til å manipulere, og dette er forenlig med spytt samles i New York City. Anvendelsen av DNase til slike prøver kan brukes til å forbedre viskositeten dermed tillater måling 10. En ekstra løsning kan være å bruke farmakologiske sialagogues som spesifikt stimulerer spytt sekresjon via den parasympatiske versus sympatiske pathway dermed produsere vannaktig spytt. En slik sialagogue er Pilocarpine 11. Endelig har α-test not blitt validert, og dette er nødvendig for å avgjøre om ytelsen er tilstrekkelig diskriminerende for kritiske nivåer av CD4-tall 12. De kritiske nivåene av CD4-tall er i den lineære delen av sigmoidal regresjonskurven som tillot disse verdiene skal beregnes ved en lineær algoritme. I denne populasjonen, den lineære regresjon for verdier <860 CD4 celler / mL (r 2 = 0,86, n = 30, p <2x10 -7) var like god som den sigmoidal regresjon (r 2 = 0,88, n = 30, p < 0,0001). Den lineære regresjon for alfa 1 PI Indekser over 67 som tilsvarer ca 350 CD4 celler / mL (r 2 = 0,88, n = 15, p = 0,002) var like god som den sigmoidal regresjon (r 2 = 0,89, n = 15, p <0,0001). Imidlertid var korrelasjonen ikke signifikant på alfa 1 PI Indekser under 67 som tilsvarte <350 CD4 celler / mL (r 2 = 0,17, p = 0,54, n = 15). Dette er en kritisk verdi siden WHO retningslinjer anbefaler en CD4 tall <350 CD4 celler / mL å kvalifisere for adgang til antiretroviral terapi 13. For å bedre avgjøre ytelsen til α-testen og forbedre følsomheten ved lavere verdier, er en ekstra 800 spytt prøvene samles i Kamerun fra 4 grupper: nyfødte-2 år, 3-5 år og 6-15 år og 16 år og eldre. I konklusjonen, er α-testen fysiologisk relevant for antallet CD4-celler i blodet ennå kan utføres ved hjelp spytt og gir dermed en ikke-invasiv, nøyaktig og presis point-of-care metode for overvåking av CD4-tall i endemiske områder uten instrumentering på en kostnad-per-test som er mindre enn en dollar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forskningen ble støttet av Harry Winston Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sialogogue, 0.05M citric acid | Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 | Sugar-Free Lemon dropS | |
| Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 | E1250 | |
| Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | S4760 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Tissue culture-treated, 96 well microplates | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 | 35-3072 | |
| Microplate Reader with filters for 405nm and 595nm | MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 | Dynex P97277 |
References
- Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study. Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).
- Lapidot, T., Petit, I. Current understanding of stem cell mobilization: The roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells. Exp. Hematol. 30, 973-981 (2002).
- Bristow, C. L. α1Antitrypsin therapy increases CD4+ lymphocytes to normal values in HIV-1 patients. Soluble factors mediating innate immune responses to HIV infection. Alfano, M. , Bentham Science Publishers. (2010).
- Bristow, C. L., Patel, H., Arnold, R. R. Self antigen prognostic for human immunodeficiency virus disease progression. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 937-942 (2001).
- Bristow, C. L., Babayeva, M. A., LaBrunda, M., Mullen, M. P., Winston, R. α1Proteinase Inhibitor regulates CD4+ lymphocyte levels and is rate limiting in HIV-1 disease. PLoS One. , Forthcoming (2011).
- de Almeida, P. D. V., Gregio, A. M. T., Machado, M. A. N., de Lima, A. A. S., Azevedo, L. R. Saliva Composition and Functions: A Comprehensive Review. J. Contemp. Dent. Pract. 9, 72-80 (2008).
- Edgar, W. M. Saliva: its secretion, composition and funcitons. Br. Dent. J. , 172-305 (1992).
- Bristow, C. L., Meo, F. di, Arnold, R. R. Specific activity of α1proteinase inhibitor and 2macroglobulin in human serum: Application to insulin-dependent diabetes mellitus. Clin. Immunol. Immunopathol. 89, 247-259 (1998).
- Pederson, E. D. Salivary levels of α2-macroglobulin, α1-antitrypsin, C-reactive protein, cathepsin G and elastase in humans with or without destructive periodontal disease. Arch. Oral Biol. 40, 1151-1155 (1995).
- Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. PNAS. 87, 9188-9192 (1990).
- LeVeque, F. G. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, dose- titration study of oral pilocarpine for treatment of radiation-induced xerostomia in head and neck cancer patients. J. Clin. Oncol. 11, 1124-1131 (1993).
- Stevens, W. Evaluating new CD4 enumeration technologies for resource-constrained countries. Nat. Rev. Microbiol. 6, S29-S38 (2008).
- WHO. 2010 ART guidelines for adults and adolescents - evidence map. , Available from: http://www.who.int/hiv/topics/treatment/evidence/en/index.html (2010).
