Summary
Метод CD4 перечисления, α-тест, описывается, который использует весь слюны обеспечивает быстрое и точное число лимфоцитов CD4. Α-тест расходы копейки и устраняет необходимость в технической подготовке, дорогостоящих реагентов, таких как моноклональные антитела, оборудование, холодильная техника, транспорт образцов, а также сбора и обработки крови.
Protocol
1. Подготовить новую рабочую решения
- TBS: 0,05 М Трис-буферном растворе, рН 7,8 (TBS). Подготовить 60 мл TBS / планшет.
- СИЗ: свиной поджелудочной железы эластазы, тип 1 (СИЗ) предусмотрена в виде суспензии. Хорошо взболтать и развести СИЗ в TBS примерно 0,01 Ед / мл. Подготовить 6 мл рабочего раствора / планшет).
- SA 3 NA: сукцинил-L-Ala-L-Ala-L-Ala-р-нитроанилид (SA 3 NA). Подготовить 0,1 М акции SA 3 NA решение в диметилсульфоксид (ДМСО) и использовать сразу или хранить при температуре -20 ° C. Подготовить 6 мл рабочего раствора / планшет путем разбавления акции SA 3 NA решение 1/100 в TBS.
- Coomassie Blue: подготовка исходного раствора 10% Кумасси Brilliant Blue R-250 (Кумасси синий) в TBS и использовать сразу или хранить при -20 ° C. Подготовить 6 мл рабочего раствора путем разбавления исходного раствора, 1/1000 в TBS.
2. Подготовить слюны
3. Микропланшетов Настройка
- Образцов: Для каждого теста хорошо, добавляют 20 мкл слюны для конечного объема 150 мкл / лунку. Смешайте с помощью пипетки, не вводя пузыри.
- КОНТРОЛЬ: положительный контроль содержит средства индивидуальной защиты, а не слюна. Отрицательный контроль содержит слюны, но не PPE.To положительного контроля и добавляют 20 мкл TBS. Для отрицательного контроля и добавляют 20 мкл слюны.
- СИЗ инкубации: Shake средств индивидуальной защиты рабочим раствором хорошо. Добавить 50 мкл рабочего СИЗ раствора в каждую лунку исключая отрицательное скважин управления. К отрицательным скважин контроль, добавить 50 мкл TBS. Инкубировать 10 мин при 23 ° C.
- ОСНОВАНИЯ ИНКУБАЦИЯ: Добавить 50 мкл SA 3 NA рабочего раствора в каждую лунку. Инкубировать 45 мин при 23 ° C.
- Coomassie Blue. Добавить 50 мкл Кумасси синий рабочий раствор </ LI>
- Считывание: абсорбцию в микропланшетов читателя, 405 нм для выявления SA 3 NA раскол, который представляет активный α 1 ИП и 595 нм для выявления Кумасси синий, которая представляет содержание белка.
4. Вычислить α 1 ИП Индекс
- НОРМАЛИЗАЦИИ в среднем 405 нм и 595 нм: для каждого х экземплярах, вычислить среднее. Вычтите отрицательные средние управления из образцов среднего. Чтобы свести к минимуму пластины к пластине изменения, нормализуют среднем путем деления каждого образца среднем на положительной средней управления следующим образом:
- РАСЧЕТ α 1 ИП INEX: Разделите нормированный 405 нм на нормированную 595 нм:
5. Представитель Результаты
Чтобы определить, α-тест может быть пригоден для использования в качестве отправной точки оказания медицинской помощи скрининг-теста для контроля лимфоцитов CD4 в эндемичных, с ограниченными ресурсами регионах, стимулировало слюны были собраны из 20 женщин и 11 мужчин ВИЧ-1 предметов посещать клинику ежедневного ухода в Камеруне. В соответствии с предварительными замечаниями при разработке α-тест с использованием слюны, собранных в Нью-Йорке, α 1 ИП Индекс в слюне, собранные в Камеруне коррелирует с уровнем CD4 (R 2 = 0,91, р <0,0001. П = 31). Отношение было определено 3 параметра сигмоидального кривой, которая соответствует доза-эффект (рис. 2A). 95% доверительный и прогнозирования интервалы изображены с синей и красной линиями, соответственно (рис. 2В).
Впредыдущего исследования мы выяснили, что CD4 + Т-клетки проявляют синусоидальной велосипедный с периодичностью 23 ± 3,5 дня в области ВИЧ-1 предметов и у пациентов с унаследованной версии α 1 ИП недостаточности (PIZZ) 3. Изображенный здесь является типичным примером компьютерной синусоиды анализ CD4 на велосипеде в не-ВИЧ-1 здоровым контролем выставки 27 дней периодичность (рис. 3А).
Созданные с помощью компьютера анализ кривой синус CD4 + Т-клеточных изменений в 6 предметов дали значения от пика до пика амплитуды и оси вращения 3. Как и следовало ожидать, ось колебаний коррелирует с амплитудой (R 2 = 0,96, р = 0,009, п = 6) (рис. 3В). У пациентов будет низким числом CD4 + T-клеток, циклические изменения клеток CD4 Т-клеток были маленькие, и у пациентов с высоким числом CD4 + Т-клеток, циклические изменения были большими.
Потому чтоЛиния регрессии изображено на рисунке 2 оценкам оси колебаний и ось колебаний коррелирует с амплитудой, амплитуда может быть вычислена для линии регрессии таким образом оценки, насколько выше и ниже линии регрессии CD4 + Т-клетки можно было бы ожидать, чтобы изменяться в зависимости от езда на велосипеде (рис. 3). Наложение амплитуды рассчитаны на рисунке 3C и доверительный интервал рассчитан на рисунке 2B, было установлено, что амплитуда (зеленая линия) находится в пределах 95% доверительного интервала (синяя линия) (рис. 3).
Рисунок 1. Процедура информация: Место лимонной кислоты во рту и сбора слюны. Добавить разбавленной слюной лунки планшета в трех экземплярах. Добавить СИЗ в каждую лунку и инкубировать 15 мин при 23 ° C. Добавить подложки СИЗ в каждую лунку и инкубировать в течение 45 мин при 23 ° C. Добавить Кумасси синий и 405 нм для выявления деятельности и средства индивидуальной защиты при 595 нм для обнаружения белка.
Рисунок 2. Сравнение α-тест со стандартным методом перечисления CD4. A) α-тест был проведен количественного α 1 ИП индекса в целом стимулировали слюны во рту. Лимфоцитов CD4 было проведено независимой медицинской лаборатории с использованием стандартных проточной цитометрии. Кровь для проточной цитометрии и слюны были собраны в одно посещение клиники. Отношения между α 1 ИП индекс и уровень CD4 был определен 3-параметр сигмоидального кривой (R 2 = 0,91, р <0,0001, п = 31). Б) 95% и прогнозирования интервалов изображен в синем и красном линий, соответственно.
Рисунок 3. Точность расчета с CD4ounts использованием α1PI Index.A) CD4 + Т-клеток выставлены синусоидальной езда на велосипеде с 27-дневная периодичность в не-ВИЧ-1 контрольная группа здоровых людей. Оси колебаний изображен (красная пунктирная линия). B) Компьютерная анализ синусоидальной CD4 Т-клеток, езда на велосипеде была использована для расчета пик-пик амплитуды и оси вращения в 4 ВИЧ-1 предметов, 1 без ВИЧ -1 PIzz тему, и не-ВИЧ-1 контрольная группа здоровых людей изображен в части А. Отношения между CD4 + Т клеток и амплитуда колебаний оси было определено 3 параметра сигмоидального кривой (R 2 = 0,96, р = 0,009, п = 6). C) сигмоидального связь между амплитудой и оси колебаний, полученных в части В) была использована для расчета ожидаемой амплитуды (зеленые линии) точек вдоль линии регрессии (черная линия) на рисунке 2. D) ожидаемая амплитуда Интервал (зеленые линии) существенно отличается от 95% доверительный интервал (синие линии), как это определено Манна-Уитни ранг Sum Test (на основе сравнения средняя разница между 95% доверительный интервал и линии регрессии (63 кл / мкл) и средняя разница между амплитудой линии и линии регрессии (37 ячеек / мкл), р = 0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Неразведенный сыворотка содержит среднем 36 мкм α 1 ИП и 3,6 мкМ α 2 макроглобулина (α 2 М) 10-кратную разницу 8. Оба белка конкурируют за связывание с индивидуальной защиты. Эти две характеристики, концентрации и СИЗ близости, были использованы для разработки метода, способного специально измерения α 1 ИП в сыворотке в присутствии конкурирующих α 2 M 8. Этот метод позволяет обнаруживать лишь 50 нм μ 1 ИП в 0,3% сыворотки. На разведение сыворотки на 2,5%, связывание α 2 м до СИЗ невозможно обнаружить, и это разведение содержит около 900 нм α 1 ИП и 90 нм α 2 М.
В отличие от сыворотки, которая состоит из 10 раз больше α 1 ИП, чем α 2 M, весь рот слюны содержится в 20 раз разница 9. Мы обнаружили в настоящем исследовании, неразбавленный, стимулировали слюнысодержится примерно в 30 раз меньше α 1 ИП, чем сыворотки, или примерно 1200 нм α 1 ИП и можно было бы ожидать, чтобы содержать около 60 нм α 2 М. Оптимальный разведение слюны для α-теста было установлено, что 13% стимулировали слюны, и это разведение должны будут содержать около 160 нм α 1 ИП и 8 нм α 2 M, концентрации α 2 M, что ниже порога обнаружения в протоколе. Из-за низкой концентрации α 2 М, то можно точно определить удельную активность α 1 ИП в слюне, не заботясь о конкуренции со стороны α 2 М. Измерение активной α 1 ИП и содержания белка в слюне позволило рассчитать α 1 ИП Индекс которая коррелирует со стандартным методом измерения CD4, проточной цитометрии. Важно отметить, что результаты регрессионного анализа (г Методы CD4 перечисление ранее не принимались во внимание изменения, что связано с велоспортом. С практической точки зрения, уровень CD4 может составлять до 200 клеток / мкл между надир и вершина с периодичностью 23-27 дней, и это справедливо вне зависимости от метода измерения CD4 + Т-клеток 3. Таким образом, оси синусоиды колебаний обеспечивает более точное измерение истинного CD4 человека + T-клеток, чем мере один день, потому что ось колебаний постоянна каждый час, каждую неделю. Хотя она и не может быть возможным непосредственно измерить оси колебаний для CD4 человека + Т-клеток, это может быть оценена с помощью средней продольной CD4 + Т-клеток до тех пор, как изменение числа лимфоцитов CD4 не превышает ожидаемую амплитуду. Большие измененияв с числом CD4 будет указывать на влияние переменных, отличных от езды на велосипеде. Линия регрессии изображено на рисунке 2, представляет собой оценку оси колебаний. Расчет ожидаемой амплитудой выше и ниже линии регрессии показал, что амплитуда находится в пределах 95% доверительного интервала. Средняя разница между 95% доверительный интервал и линии регрессии составляет 63 CD4 клеток / мкл, а средняя разница между амплитудой и линии регрессии составляет 37 CD4 клеток / мкл. Это можно интерпретировать так, что 95% от числа лимфоцитов CD4 рассчитывается из α-тест измерения будет находиться в пределах примерно 63 CD4 клеток / мкл от фактического количества CD4 и, что примерно 58% от этой разницы будет связано с велосипедных CD4. Таким образом, точность α-тест расстояние между доверительный интервал и амплитуда которых составляет около 26 CD4 клеток / мкл, а точность α-тест является соотношение coefficieП линии регрессии которых составляет 0,95 или 95%. Есть несколько ограничений на α-тест, как описано здесь, но решения легко доступны. Например, хотя α-тест описано использует планшет формата, возможность выполнять α-тест с помощью одного разведение слюны позволяет α-тест, который будет использоваться с щуп технологии, приборостроение бесплатно, технологически простой системы. Примерно 2% от слюны, собранных в Камеруне были слишком вязким, чтобы манипулировать, и это согласуется со слюной, собранные в Нью-Йорке. Применение ДНКазы такие образцы могут быть использованы для улучшения вязкости, тем самым разрешая измерения 10. Дополнительного решения может быть использование фармакологических sialagogues, что специально стимулируют секрецию слюны через парасимпатическую по сравнению с симпатической путь таким образом производя водянистая слюна. Одним из таких является средство, стимулирующее слюноотделение пилокарпин 11. Наконец, α-тест не имеетт еще не утвержден, и это необходимо для определения производительности достаточно для дискриминационного критические уровни лимфоцитов CD4 12. Критические уровни лимфоцитов CD4 находится в линейной области сигмоидального кривой регрессии, которые позволили эти значения рассчитываются линейным алгоритмом. В этой группе населения, линейной регрессии значений <860 CD4 клеток / мкл (R 2 = 0,86, п = 30, р <2x10 -7) было так хорошо, как сигмоидального регрессии (R 2 = 0,88, п = 30, р < 0,0001). Линейной регрессии для α 1 индексов PI выше 67 что соответствует примерно 350 CD4 клеток / мкл (R 2 = 0,88, п = 15, р = 0,002) была так хороша, как сигмоидального регрессии (R 2 = 0,89, п = 15, р <0,0001). Тем не менее, корреляция не была значимой на α 1 индексов PI ниже 67, что соответствовало <350 CD4 клеток / мкл (R 2 = 0,17, р = 0,54, п = 15). Это критическое значение, так как WHO рекомендуют CD4 <350 CD4 клеток / мкл, чтобы претендовать на доступ к антиретровирусной терапии 13. Для лучшего определения характеристик α-тест и улучшить чувствительность при более низких значениях, еще 800 образцов слюны собираются в Камерун из 4 групп: новорожденные, 2-х лет, 3-5 лет и 6-15 лет и 16 лет и старше. В заключение отметим, что α-тест является физиологически, относящихся к числу клеток CD4 в крови еще можно выполнить с помощью слюны что обеспечивает неинвазивный, точный и конкретный пункт оказания медицинской помощи метода контроля лимфоцитов CD4 в эндемичных районах, не на приборы цена за тест, который составляет менее одного доллара.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Исследование было поддержано Harry Winston исследовательский фонд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sialogogue, 0.05M citric acid | Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 | Sugar-Free Lemon dropS | |
| Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 | E1250 | |
| Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | S4760 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Tissue culture-treated, 96 well microplates | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 | 35-3072 | |
| Microplate Reader with filters for 405nm and 595nm | MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 | Dynex P97277 |
References
- Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study. Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).
- Lapidot, T., Petit, I. Current understanding of stem cell mobilization: The roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells. Exp. Hematol. 30, 973-981 (2002).
- Bristow, C. L. α1Antitrypsin therapy increases CD4+ lymphocytes to normal values in HIV-1 patients. Soluble factors mediating innate immune responses to HIV infection. Alfano, M. , Bentham Science Publishers. (2010).
- Bristow, C. L., Patel, H., Arnold, R. R. Self antigen prognostic for human immunodeficiency virus disease progression. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 937-942 (2001).
- Bristow, C. L., Babayeva, M. A., LaBrunda, M., Mullen, M. P., Winston, R. α1Proteinase Inhibitor regulates CD4+ lymphocyte levels and is rate limiting in HIV-1 disease. PLoS One. , Forthcoming (2011).
- de Almeida, P. D. V., Gregio, A. M. T., Machado, M. A. N., de Lima, A. A. S., Azevedo, L. R. Saliva Composition and Functions: A Comprehensive Review. J. Contemp. Dent. Pract. 9, 72-80 (2008).
- Edgar, W. M. Saliva: its secretion, composition and funcitons. Br. Dent. J. , 172-305 (1992).
- Bristow, C. L., Meo, F. di, Arnold, R. R. Specific activity of α1proteinase inhibitor and 2macroglobulin in human serum: Application to insulin-dependent diabetes mellitus. Clin. Immunol. Immunopathol. 89, 247-259 (1998).
- Pederson, E. D. Salivary levels of α2-macroglobulin, α1-antitrypsin, C-reactive protein, cathepsin G and elastase in humans with or without destructive periodontal disease. Arch. Oral Biol. 40, 1151-1155 (1995).
- Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. PNAS. 87, 9188-9192 (1990).
- LeVeque, F. G. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, dose- titration study of oral pilocarpine for treatment of radiation-induced xerostomia in head and neck cancer patients. J. Clin. Oncol. 11, 1124-1131 (1993).
- Stevens, W. Evaluating new CD4 enumeration technologies for resource-constrained countries. Nat. Rev. Microbiol. 6, S29-S38 (2008).
- WHO. 2010 ART guidelines for adults and adolescents - evidence map. , Available from: http://www.who.int/hiv/topics/treatment/evidence/en/index.html (2010).
