Summary
En CD4 uppräkning metod, α-test, beskrivs som använder hela saliv för att ge snabba och korrekta CD4-tal. De α-test kostar småpengar och eliminerar behovet av tekniska utbildning, dyra reagens såsom monoklonala antikroppar, instrumentering, kyl, transport av prover, samt insamling och hantering av blod.
Abstract
Det finns ett akut behov av prisvärda CD4 räkning för att övervaka HIV-sjukdom. CD4 uppräkning är utom räckhåll i resurssvaga begränsade regioner på grund av den tid och restriktioner temperatur, avancerade teknik, och kostnader för reagenser, särskilt monoklonala antikroppar för att mäta CD4 på blodkropparna, den enda för närvarande acceptabel metod. Ett vanligt använt kostnadsbesparande och tidsbesparande laboratoriet strategi är att beräkna, snarare än mäta vissa blodvärden. Till exempel är LDL-nivåer beräknas med användning av de uppmätta nivåerna av totalt kolesterol, HDL och triglycerider 1. Sålunda räknar identifiering av cellfria korrelerar att direkt reglera antalet av CD4 + T-celler skulle kunna tillhandahålla en noggrann metod för beräkning av CD4 på grund av den fysiologiska relevansen av de korrelerar.
Antalet stamceller som anger blod och är avsedda att bli cirkulerande CD4 +-T-celler bestäms av kemokin CXCL12 ennd dess receptor CXCR4 på grund av deras inverkan på rörelse 2. Förfarandet enligt stamceller förflyttning in i blod är dessutom regleras genom cellytan humant leukocytelastas (HLE CS) och HLE CS-reaktiv aktiv α 1-proteinasinhibitor (α 1 PI, α 1-antitrypsin, SerpinA1) 3. Hos HIV-1 sjukdom, α 1 PI inaktiveras på grund av sjukdomsprocesser 4. I början asymtomatiska kategorier av HIV-1 sjukdom, var aktiva α 1 PI visade sig vara under det normala i 100% av obehandlade HIV-1-patienter (median = 12 M, och för att uppnå normala nivåer under den symptomatiska kategorierna 4, 5. Här Mönstret har tillskrivits immunförsvaret inaktivering, inte tillräckligt syntes, proteolytisk inaktivering eller syresättning. Vi observerade att i HIV-1 patienter med> 220 CD4-celler / l, var CD4 korrelerade med serumnivåer av aktiv α 1 PI (r 2 = 0,93, p < 0,0001, n = 26) och inaktiva α 1 PI (r 2 = 0,91, p <0,0001, n = 26) 5. Administration av α 1 PI till HIV-1 infekterade och oinfekterade personer resulterade i dramatiska ökningar i CD4 tyder α 1 PI deltar i regleringen av antalet CD4 + T-celler i blodet 3.
Med stimulering, innehåller helt saliv räcker serös exsudat (plasma innehåller proteinhaltigt material som passerar genom blodkärlens väggar i saliven) för att möjliggöra mätning av aktiv α 1 PI och sambandet mellan denna mätning är ett bevis att det är en exakt metod för att beräkna antal CD4-celler. Kortfattat sialogogues såsom tuggummi eller citronsyra stimulera utsöndring av serum i hela munnen saliv. Efter stimulering serum exsudation, är aktiviteten av serum α 1 PI i saliv mätt genom dess förmåga att inhibera elastas-aktivitet. Porcint pankreatiskt elastas (PPE)är en lätt tillgänglig billig källa av elastas. PPE binder till α 1 PI bildar en en-till-ett komplex som förhindrar PPE från klyva dess specifika substrat, av vilka en är den kolorimetriska peptid, succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilid (SA 3 NA). Inkubera saliv med en mättande koncentration av PPE under 10 min vid rumstemperatur tillåter bindning av PPE till alla aktiva α 1 PI i saliv. Den resulterande hämning av personlig skyddsutrustning av aktiv α 1 PI kan mätas genom att tillsätta PPE underlaget SA 3 NA. (Figur 1). Även om CD4-antal mäts i termer av blodvolymen (CD4 celler / fil), är koncentrationen av α 1 PI i saliv relaterat till koncentrationen av serum i saliv, för att inte volym saliv, eftersom volymen kan variera avsevärt under dag och person till person 6. Emellertid är praktiskt taget allt protein i saliv grund serumhalt, och proteinhalten i saliv är MEAmätbara 7. Således är aktiv α 1 PI i saliv beräknas som förhållandet mellan till saliv proteininnehåll och benämns α 1 PI index. Resultat som presenteras här visar att α 1 PI Index ger en noggrann och exakt fysiologiska metod för beräkning av CD4-tal.
Protocol
1. Förbered Färska Fungerande lösningar
- TBS: 0,05 M Tris-buffrad saltlösning, pH 7,8 (TBS). Framställ 60 ml TBS / mikroplatta.
- PPE: Porcint pankreatiskt elastas, typ 1 (PPE) är anordnad som en suspension. Skaka väl och späd PPE i TBS till cirka 0,01 U / ml. Framställ 6 ml arbetslösning / mikroplatta).
- SA 3 NA: succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilid (SA 3 NA). Framställa 0,1 M stamlösning SA 3 Na-lösning i dimetylsulfoxid (DMSO) och använd omedelbart eller lagra vid -20 ° C. Framställ 6ml arbetslösningen / mikroplatta genom utspädning lager SA 3 Na-lösning 1/100 i TBS.
- Coomassie Blue: Framställ en förrådslösning av 10% Coomassie Brilliant Blue R-250 (Coomassie Blue) i TBS och använd omedelbart eller lagra vid -20 ° C. Framställ 6 ml arbetslösning genom att späda stamlösningen 1/1000 i TBS.
2. Framställ Saliv
3. Mikrotiterplatta Set-up
- PROVER: Till varje testbrunn, tillsätts 20 | il saliv för en slutlig volym av 150 pl / brunn. Blanda genom att pipettera utan att införa bubblor.
- KONTROLLER: Den positiva kontrollen innehåller PPE, men ingen saliv. Den negativa kontrollen innehåller saliv, men ingen PPE.To den positiva kontrollen brunn sättes 20 | il TBS. Till den negativa kontrollen brunn sättes 20 | il saliv.
- PPE Inkubering: Skaka PPE arbetslösning bra. Tillsätt 50 pl PPE arbetslösningen till varje brunn med undantag de negativa kontrollkärlen. Till de negativa kontrollkärlen, tillsätt 50 | il TBS. Inkubera 10 min vid 23 ° C.
- Substratinkubation: Tillsätt 50 | il SA 3 NA arbetslösning till varje brunn. Inkubera 45 min vid 23 ° C.
- Coomassie Blue. Tillsätt 50 pl Coomassie Blue arbetslösning </ Li>
- LÄS-UT: Läs absorbans i mikroplattläsare, A 405 nm för att detektera SA 3 NA klyvning som representerar aktiv α 1 PI och A 595 nm för att detektera Coomassie Blue, som representerar proteininnehållet.
4. Beräkna α 1 PI Index
- NORMALISERA i genomsnitt en 405 nm och en 595 nm: För varje tre exemplar, beräkna genomsnittet. Subtrahera Negativ kontroll genomsnittet från provet genomsnittet. För att minimera platta till platta variation normalisera de medelvärden genom att dividera varje prov genomsnittliga genom den positiva kontrollen genomsnittliga enligt följande:
- Beräkna α 1 PI INEX: Dela normaliserade A 405 nm av normaliserade A 595 nm:
5. Representativa resultat
För att bestämma huruvida α-test kan vara lämpliga för användning som en point-of-care screeningtest för att övervaka CD4 i endemiska och begränsade resurser regioner stimulerades saliv in från 20 kvinnor och 11 män HIV-1 patienter deltar kliniken för rutinmässig vård i Kamerun. I överensstämmelse med preliminära iakttagelser under utvecklingen av α-test med saliv samlas i New York City, α 1 PI Index i saliv samlas i Kamerun korrelerade med antal CD4 (r 2 = 0,91, p <0,0001. N = 31). Förhållandet definierades genom en 3-parameter sigmoidal kurva som är förenlig med en dos-respons-förhållande (figur 2A). 95% förtroende och intervaller prognosverktyg skildras med blå och röda linjer, respektive (Figur 2B).
Ien tidigare studie, bestämde vi att CD4 + T-celler uppvisar sinusformad cykling med periodicitet 23 ± 3,5 dagar i HIV-1 patienter och patienter med den ärvda versionen av α 1 PI brist (Pizz) 3. Avbildas här är ett representativt exempel på dator-genererade sinuskurva analys av CD4 cykling i en icke-HIV-1 frisk kontrollgrupp uppvisar 27 dagar periodicitet (Figur 3A).
Datorgenererad sinuskurva analys av CD4 + T-cell-förändringar i 6 försökspersoner gav värden för topp-till-topp-amplituden och svängningsaxel 3. Såsom kunde förväntas var svängningsaxel korrelerade med amplituden (r2 = 0,96, p = 0,009, n = 6) (figur 3B). Hos patienter kommer låga CD4 T + celltal var cykliska förändringar i CD4 T-celler små och hos patienter med höga CD4 + T-celler räknas var cykliska förändringar stora.
Eftersom denregressionslinjen avbildas i figur 2 beräknar den svängningsaxel och den svängningsaxel är korrelerad med amplitud, amplitud kan beräknas för regressionslinjen därigenom uppskatta hur långt över och under regressionslinjen CD4 + T-celler skulle förväntas variera beroende på cykling (Figur 3C). Överliggande amplituden beräknas i figur 3C och konfidensintervallet beräknats i figur 2B, visade det sig att amplituden (grön linje) ligger inom 95% konfidensintervall (blå linje) (Figur 3D).
Figur 1. Förfarande Sammanfattning: Placera citronsyra i mun och samla saliv. Tillsätt utspädd saliv till brunnar i en mikroplatta i triplikat. Lägg PPE till varje brunn och inkubera under 15 minuter vid 23 ° C. Tillsätt PPE substrat till varje brunn och inkubera under 45 min vid 23 ° C. Tillsätt Coomassie Blue och avlästes vid 405 nm för att detektera PPE aktivitet och vid 595 nm för att detektera proteinet.
Figur 2. Jämförelse av den α-testet med standard CD4 uppräkning metod. A) Den α-test utfördes genom kvantifiering av α 1 PI Index i stimulerade hela munnen saliv. CD4-antal utfördes av en oberoende medicinsk laboratorium med standard flödescytometri. Blod för flödescytometri och saliv samlades upp vid samma klinikbesök. Förhållandet mellan α 1 PI Index och antal CD4 definierades av en 3-parameter sigmoidal kurva (r 2 = 0,91, p <0,0001, n = 31). B) 95% förtroende och intervaller prognosverktyg visas i blått och rött linjer.
Figur 3. Noggrannhet för beräkning av CD4 counts använder α1PI Index.A) CD4 + T-celler uppvisade sinusformad cykel med 27 dagars periodicitet i en icke-HIV-1 frisk kontroll. Svängningsaxeln avbildas (röd streckad linje). B) Dator genereras sinusvåg analys av CD4-T-cell cykel användes för att beräkna topp-till-topp-amplituden och svängningsaxel i 4 HIV-1 ämnen, 1 icke-HIV- -1 Pizz ämne, och den icke-HIV-1 frisk kontrollgrupp som avbildas i del A. Förhållandet mellan CD4 T + celler amplitud och svängningsaxel definierades av 3-parameter sigmoidal kurva (r 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6). C) sigmoidala förhållandet mellan amplitud och svängningsaxel härledas i del B) användes för att beräkna den förväntade amplituden (gröna linjer) av punkter längs regressionslinjen (svart linje) från figur 2. D) den förväntade amplituden intervall (gröna linjer) var signifikant skild från 95% konfidensintervall (blå linjer) som bestäms av Mann Whitney Rank Sum Test (baserat på en jämförelse av medianen mellan den 95% konfidensintervall och regressionslinjen (63 celler / | al) och medianvärdet skillnaden mellan amplituden linje och regressionslinjen (37 celler / | il), p = 0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Outspätt serum innehåller median 36 pM α 1 PI och 3,6 | iM α 2 makroglobulin (α 2 M) en 10-faldig skillnad 8. Båda proteinerna att konkurrera för bindning till PPE. Dessa två egenskaper, koncentration och PPE affinitet, har utnyttjats för att utveckla en metod som är kapabel att specifikt mäta α 1 PI i normalt serum i närvaro av konkurrerande α 2 M 8. Denna metod kan detektera så lite som 50 nM μ 1 PI 0,3% serum. Vid en serumutspädning på 2,5%, blir bindningen av α 2 M till PPE odetekterbar, och denna spädning innehåller ungefär 900 nm α 1 PI och 90 nM α 2 M.
I motsats till serum som är sammansatt av 10-faldigt mer α 1 PI än α 2 M, hela munnen saliv innehåller en 20-faldig skillnad 9. Vi funnit i föreliggande studie att outspädd, stimulerade salivinnehåller cirka 30-faldigt mindre α 1 PI än serum-eller ca 1200 nM α 1 PI och skulle förväntas innehålla omkring 60 nM α 2 M. Den optimala saliv utspädning för α-testet visade sig vara 13% stimulerade saliv, och denna utspädning skulle förväntas innehålla omkring 160 nM α 1 PI och 8 nM α 2 M, en koncentration av α 2 M som är lägre än tröskelvärdet för detektion i protokollet. På grund av den låga koncentrationen av α 2 M, är det möjligt att noggrant bestämma den specifika aktiviteten hos α 1 PI i saliv utan oro för konkurrens från α 2 M. Mätningar av aktiva α 1 PI-och proteinhalt i saliv möjliggjorde beräkning av α 1 PI Index som visade sig korrelera med standardmetoden för att mäta CD4, flödescytometri. Viktigt är att resultaten av regressionsanalys (r CD4 uppräkning metoder har inte tidigare tagit hänsyn till den variation som beror på cykling. I praktiken kan CD4 variera med så mycket som 200 celler / mikroliter mellan Nadir och toppen med en periodicitet på 23-27 dagar, och detta gäller oberoende av vilken metod för mätning av CD4 + T-celler 3. Således ger sinusvåg svängningsaxel en mer rättvisande mått på en individs sanna CD4 + T celler än en enda dag mått eftersom svängningsaxel är konstant timme till timme, vecka till vecka. Även om det kanske inte är möjligt att direkt mäta den svängningsaxel för en individs CD4 + T-celler, kan denna bestämmas med användning av ett genomsnitt av längsgående CD4 + T-cellantal så länge som variationen i CD4-antal inte överstiger den förväntade amplituden. Stor variationS i CD4-antal tyder inflytande andra variabler än cykling. Regressionslinjen avbildas i figur 2 är en uppskattning av den svängningsaxel. Beräkningen av den förväntade amplituden över och under regressionslinjen visade att amplituden ligger inom 95% konfidensintervall. Medianen mellan den 95% konfidensintervall och regressionslinjen är 63 CD4 celler / | il, och medianvärdet skillnaden mellan amplituden och regressionslinjen är 37 CD4 celler / | il. Detta kan tolkas som att 95% av de CD4 beräknas från α-test mätningarna kommer att vara inom ca 63 CD4 celler / l från de faktiska CD4 och att cirka 58% av denna skillnad kommer att bero på CD4 cykling. Sålunda är precisionen hos α-testet avståndet mellan konfidensintervall och amplitud som är ungefär 26 CD4-celler / | al, och noggrannheten hos α-testet är det korrelationen coefficient av den regressionslinje som är 0,95 eller 95%. Det finns flera faktorer som begränsar den α-testet som beskrivs häri, men lösningar är lätt tillgängliga. Till exempel, även om α-testet beskrivet använder en mikroplattformat ger förmågan att utföra α-test med användning av en enda saliv utspädning av α-test som skall användas med doppstickan teknik, ett instrument-fri, tekniskt enkelt system. Ungefär 2% av de salivprover som samlats i Kamerun var alltför trögflytande för att manipulera, och detta är förenligt med saliv samlas i New York City. Tillämpningen av DNas till sådana prover kan användas för att lindra viskositet och därigenom tillåta mätning 10. En ytterligare lösning kan vara att använda farmakologiska sialagogues som specifikt stimulerar saliv sekretion via den parasympatiska kontra sympatiska väg därigenom producera vattnig saliv. En sådan sialagogue är pilokarpin 11. Slutligen har α-test nummert ännu validerats, och det är nödvändigt att avgöra om resultatet är tillräckligt diskriminerande för kritiska nivåer för CD4-tal 12. De kritiska nivåerna av CD4 är i det linjära området av sigmoidal regressionskurvan som tillät dessa värden skall beräknas med en linjär algoritm. I denna population, den linjära regressionen för värden <860 CD4 celler / ul (r 2 = 0,86, n = 30, p <2x10 -7) var lika bra som sigmoidal regression (r 2 = 0,88, n = 30, p < 0,0001). Den linjära regression för alfa-1 PI Index över 67 vilket motsvarar ungefär 350 CD4 celler / l (r 2 = 0,88, n = 15, p = 0,002) var lika bra som sigmoidal regression (r 2 = 0,89, n = 15, p <0,0001). Emellertid var korrelationen inte signifikant vid a-1 PI Index nedan 67 som motsvarade <350 CD4 celler / | al (r2 = 0,17, p = 0,54, n = 15). Detta är ett kritiskt värde, eftersom VHO riktlinjer rekommenderar en CD4 <350 CD4 celler / ul att kvalificera sig för tillgång till antiretroviral behandling 13. För att bättre bestämma prestanda α-test och förbättra känsligheten vid lägre värden, ytterligare 800 salivprov samlas i Kamerun från 4 grupper: nyfödda-2 år, 3-5 åriga kvinnor och 6-15 år och 16 år och äldre. Sammanfattningsvis är α-test fysiologiskt relevant till antalet CD4-celler i blodet men kan utföras med saliv vilket ger en icke-invasiv och exakta point-of-care metod för övervakning CD4 i endemiska områden utan instrumentering med en kostnad per-test som är mindre än en dollar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Forskning som stöds av Harry Winston Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sialogogue, 0.05M citric acid | Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 | Sugar-Free Lemon dropS | |
| Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 | E1250 | |
| Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | S4760 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Tissue culture-treated, 96 well microplates | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 | 35-3072 | |
| Microplate Reader with filters for 405nm and 595nm | MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 | Dynex P97277 |
References
- Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study. Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).
- Lapidot, T., Petit, I. Current understanding of stem cell mobilization: The roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells. Exp. Hematol. 30, 973-981 (2002).
- Bristow, C. L. α1Antitrypsin therapy increases CD4+ lymphocytes to normal values in HIV-1 patients. Soluble factors mediating innate immune responses to HIV infection. Alfano, M. , Bentham Science Publishers. (2010).
- Bristow, C. L., Patel, H., Arnold, R. R. Self antigen prognostic for human immunodeficiency virus disease progression. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 937-942 (2001).
- Bristow, C. L., Babayeva, M. A., LaBrunda, M., Mullen, M. P., Winston, R. α1Proteinase Inhibitor regulates CD4+ lymphocyte levels and is rate limiting in HIV-1 disease. PLoS One. , Forthcoming (2011).
- de Almeida, P. D. V., Gregio, A. M. T., Machado, M. A. N., de Lima, A. A. S., Azevedo, L. R. Saliva Composition and Functions: A Comprehensive Review. J. Contemp. Dent. Pract. 9, 72-80 (2008).
- Edgar, W. M. Saliva: its secretion, composition and funcitons. Br. Dent. J. , 172-305 (1992).
- Bristow, C. L., Meo, F. di, Arnold, R. R. Specific activity of α1proteinase inhibitor and 2macroglobulin in human serum: Application to insulin-dependent diabetes mellitus. Clin. Immunol. Immunopathol. 89, 247-259 (1998).
- Pederson, E. D. Salivary levels of α2-macroglobulin, α1-antitrypsin, C-reactive protein, cathepsin G and elastase in humans with or without destructive periodontal disease. Arch. Oral Biol. 40, 1151-1155 (1995).
- Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. PNAS. 87, 9188-9192 (1990).
- LeVeque, F. G. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, dose- titration study of oral pilocarpine for treatment of radiation-induced xerostomia in head and neck cancer patients. J. Clin. Oncol. 11, 1124-1131 (1993).
- Stevens, W. Evaluating new CD4 enumeration technologies for resource-constrained countries. Nat. Rev. Microbiol. 6, S29-S38 (2008).
- WHO. 2010 ART guidelines for adults and adolescents - evidence map. , Available from: http://www.who.int/hiv/topics/treatment/evidence/en/index.html (2010).
