प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से व्युत्पन्न चूहों की पीढ़ी

Summary

जनरेटिंग प्रेरित pluripotent स्टेम सेल लाइनों (iPSC) विकास संभावित भिन्न लाइनों का उत्पादन भी जब वे pluripotency के लिए मानक परीक्षणों के पास. यहाँ हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन iPSCs, जो रखने पूर्ण pluripotency iPSC लाइनों के रूप में परिभाषित करता है पूरी तरह से व्युत्पन्न चूहों का उत्पादन¹.

Abstract

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution². Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types². This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.

The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)^3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage⁶. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.

Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC¹. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs^3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines^8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines^13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and “all- iPSC” mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Protocol

Boland एट अल प्रकृति की रिपोर्ट में अनुसंधान के क्षेत्र में इस पद्धति का इस्तेमाल किया गया था 91-96, 461 (2009). 1 1. Lentivirus की तैयारी इस प्रोटोकॉल डॉक्सीसाइक्लिन-inducible lentiviral शटल वैक्टर है कि Oct4 के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना, Sox2, Klf4, और सी Myc एक teto प्रतिक्रिया तत्व के नियंत्रण के तहत कार्यरत हैं. Transgenes रिवर्स टेट्रासाइक्लिन पार सक्रिय प्रोटीन, rtTAM2.2 16, जो reprogramming डॉक्सीसाइक्लिन की उपस्थिति में कारक की अभिव्यक्ति लाती द्वारा सक्रिय कर रहे हैं. इस प्रणाली कसकर नियंत्रित, reprogramming कारकों की उच्च अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है. यहां इस्तेमाल किया lentiviral वैक्टर आत्म निष्क्रिय कर रहे हैं और इस प्रकार निम्नलिखित जीनोमिक एकीकरण नकल नहीं कर सकते. हालांकि, सतर्कता जब lentiviruses के साथ काम कर रहे हैं और प्रयोगशालाओं अनुपालन BSL2 (यूएसए) और S2 मानकों (यूरोप) के साथ किया जाना चाहिए की आवश्यकता है. HEK293T कोशिकाओं और पारित होने के कम से कम टीआरए से पहले पिघलना को एक बारnsfection. सेल 37 पर HEK मध्यम में subconfluent घनत्व पर रखा जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस, 5% एक humidified वातावरण में सीओ 2. नियमित बीतने के कोशिकाओं 1:06-1:10 के एक विभाजन अनुपात के साथ हर दिन 2. 8 ~ बीज x 6 10 25 मिलीलीटर HEK मध्यम के साथ HEK293T cells/T150. प्रत्येक lentivirus तैयारी के लिए T150 एक का प्रयोग करें. निम्नलिखित कैल्शियम फॉस्फेट वर्षा दिन transfect HEK293T कोशिकाओं. (नोट: हमारे हाथ में कैल्शियम फॉस्फेट वर्षण की संभावना नियमित 80-90% अभिकर्मक दक्षता में परिणाम है, तथापि, 2000 Lipofectamine के रूप में cationic लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मकों भी इस्तेमाल किया जा सकता है). प्रत्येक के लिए तैयार रहना वायरस के लिए दो 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब तैयार. "ए" और "बी" ट्यूब लेबल. ट्यूब एक, में से प्रत्येक के 10 ग्राम: lentiviral शटल वेक्टर एन्कोडिंग reprogramming कारकों (या rtTAM2.2), वायरल पैकेजिंग वैक्टर, और प्लाज्मिड एन्कोडिंग वायरल लिफाफा प्रोटीन, VSVg. एक ट्यूब के लिए 186 μl 2 एम 2 CACL जोड़ें, और बाँझ एच 2 हे के साथ 1.5 मिलीग्राम मात्रा में लाने. ट्यूब बी: 1.5 मिलीलीटर 2x HBS (कमरे के तापमान को पूर्व गरम). विंदुक एक ट्यूब में मिश्रण जब तक यह एक समरूप समाधान है. समाधान जोड़ने के समाधान बी dropwise और 2-3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े चलो. Aspirate HEK293T कोशिकाओं के विकास के माध्यम और 22 मिलीलीटर पेनिसिलिन बिना पूर्व गर्म HEK मध्यम और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ बदलें. पिपेट संयुक्त समाधान अटल बिहारी (कैल्शियम फॉस्फेट तलछट) सीधे कोशिकाओं HEK293T और सौम्य कमाल द्वारा समान रूप से वितरित. Lentivirus साथ HEK 293T कोशिकाओं के अभिकर्मक के बाद 24 घंटा, मध्यम विकास को हटाने और यह ताजा, पूर्व गर्म HEK मध्यम के 25 मिलीलीटर के साथ बदलें. इनक्यूबेटर ट्रांसफ़ेक्ट HEKs लौटें. Lentivirus साथ HEK 293T कोशिकाओं के अभिकर्मक के बाद 48 घंटा, विकास ट्रांसफ़ेक्ट HEKs से lentiviral कणों से युक्त मीडिया इकट्ठा. काटा 3,000 XG पर centrifugation द्वारा वायरल समाधान से 5 मिनट के 4 डिग्री सेल्सियस के लिए कण मलबा हटाने Ultracentrifugation अपरोक्ष वायरस ध्यान लगाओऊ 112.000 XG में 2 घंटे के लिए एक 20% sucrose (2 मिलीलीटर मिलीलीटर sucrose/25 वायरल तैरनेवाला) 4 ° तकिया सी. 0.4 मिलीलीटर MEF मध्यम में वायरल गोली सौम्य कमाल के साथ 15-30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर निलंबित. एकल उपयोग aliquots (यानी 50 μl) -80 में वायरल कणों स्टोर डिग्री सेल्सियस 2. माउस भ्रूणीय Fibroblasts की Reprogramming के लिए तैयार (MEF) नोट: यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल ई 13.5 TEC assays में उपयोग के लिए माउस भ्रूणीय fibroblasts से iPSCs की व्युत्पत्ति से संबंधित है. जबकि अन्य समूहों वयस्क दाता सेल स्रोतों से सभी iPSC चूहों उत्पन्न किया है, हम अन्य प्रकार सेल पर इस विधि का परीक्षण किया है और कुछ नहीं कर सकते हैं कि दाता सेल प्रकार एक कारक नहीं है. माउस समय matings सेट. भ्रूण 13.5 दिन (E13.5), गर्भवती महिला euthanize और गर्भाशय सींग से भ्रूण टुकड़े करना. प्लेस और 1x पीबीएस में दुकान भ्रूण बर्फ पर (पूर्व ठंडा डिग्री सेल्सियस 4). Extraembryonic ऊतकों (यानी निकालेंजरायु भ्रूणावरण, और अपरा). भ्रूण का सिर काटना और पूंछ हटाने के लिए (वैकल्पिक – अगर जीनोटाइपिंग के लिए आवश्यक) और अंग. आंतरिक अंगों, संदंश का उपयोग कर या एक स्कूप के आकार का रंग स्कूप और एक स्केलपेल या तेज कैंची की ब्लेड के साथ शेष लोथ बोटी – बोटी करना. 5 मिलीग्राम पूर्व ठंडा 1x पीबीएस में कीमा बनाया हुआ लोथ धो लें. 5 मिनट के लिए 200 XG अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला Aspirate. 5 मिलीलीटर 0.25% ट्रिप्सिन-EDTA और सेते में गोली 37 डिग्री सेल्सियस पर 20-30 मिनट के लिए जोरदार झटकों के साथ निलंबित. MEF मध्यम (37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गरम), मिश्रण और 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र के 5 मिलीलीटर जोड़ें. पूर्व गर्म MEF मध्यम में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली Aspirate. प्लेट एक 6-0.1% जेलाटीन के साथ अच्छी तरह से पूर्व लेपित प्लेट की 2-3 कुओं में dissociated MEFs. यह 1 पारित होने माना जाता है. 1:04-01:05 हर 48 घंटा का एक कमजोर पड़ने पर पारित होने MEFs. पारित होने पर 3 MEFs lentiviral पारगमन के लिए तैयार कर रहे हैं. 3. IPSC लाइन्स की व्युत्पत्ति lentiviral पारगमन के पहले दिन, 3 ~ बीज x 10 5 में एक 6-0.1% जेलाटीन के साथ अच्छी तरह से पूर्व लेपित प्लेट की एक अच्छी तरह से प्राथमिक MEFs. दिन 1: प्राथमिक MEFS lentiviral पारगमन के लिए 80-90% मिला हुआ होना चाहिए. सीधे MEF मीडिया और सेते 37 में रातोंरात MEFs साथ lentiviral कणों जोड़ें डिग्री सेल्सियस, एक humidified वातावरण में 5% सीओ 2. अगले दिन (2 दिन) मध्यम aspirate और 1x पीबीएस के 3 मिलीलीटर के साथ दो बार धोने के लिए वायरल कणों को हटा. 0.5 पूर्व गरम कोशिकाओं और 37 पर सेते डिग्री सेल्सियस सामयिक कमाल के साथ 3-5 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन-EDTA. मिलीलीटर जोड़ें एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्त महीन चुर्ण बनाना. प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए एक एकल कक्ष निलंबन को सुनिश्चित करने के लिए. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार 5 मिलीलीटर MEF मीडिया युक्त ट्यूब में स्थानांतरण MEFs. 5 मिनट के लिए 200 XG अपकेंद्रित्र. MEF मध्यम में सतह पर तैरनेवाला और धीरे resuspend कोशिकाओं Aspirate. समान रूप से एक अच्छी तरह से 6 पी के दो कुओं के बीच सेल निलंबन विभाजितदेर जेलाटीन 0.1% के साथ पूर्व में लिपटे. थाली आगे और पीछे रॉक, पक्ष की ओर, और एक बार अच्छी तरह से भर कोशिकाओं का भी वितरण को प्राप्त करने के लिए एक परिपत्र गति में. 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस, एक humidified वातावरण में 5% सीओ 2. दिन 3: दोहराएँ कोशिकाओं समान रूप से एक से एक 6 अच्छी तरह से थाली जेलाटीन 0.1% के साथ पूर्व में लिपटे 3 कुओं विभाजित करने के लिए अच्छी तरह से करने के अलावा 4-9 कदम. यह 6 कुओं के प्राथमिक fibroblasts transduced निकलेगा. दिवस 4: 10 ग्राम / 5/6 कुओं मिलीलीटर की एक एकाग्रता में जोड़ें डॉक्सीसाइक्लिन (Dox). एक अच्छी तरह से करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए इलाज रहना चाहिए. 1.9 मिमी 5 Dox के साथ इलाज के कुओं के 3 VPA जोड़ें. VPA MEFs के प्रसार की दर कम कर देता है. घने संस्कृतियों की MEFs VPA करने के लिए लंबे समय तक निवेश बर्दाश्त जबकि subconfluent संस्कृतियों 2-5 दिनों के भीतर senesce करते हैं. इसलिए, MEFS 100% सहधारा जब VPA जोड़ा जाता है होना चाहिए. नोट: हम हमारे reprogramming प्रयोगों में VPA का उपयोग करें, क्योंकि यह एक ज्ञात epigenetic आपरिवर्तक है, और श किया गयाiPSC 17 पीढ़ी हालांकि पूरी तरह से pluripotent iPSC लाइनों पैदा करने के लिए सम्मान के साथ और प्रभाव VPA कार्रवाई के तंत्र नहीं जाना जाता है की दक्षता बढ़ाने के लिए खुद के. दिन 5: मध्यम Aspirate, धोने और पहले के रूप में कोशिकाओं trypsinize. पारित होने के एक 15 सेमी 2 टिशू कल्चर 0.1% जेलाटीन और पूर्व लेपित ES सेल माध्यम में 10 2 व्यंजन सेमी ताजा Dox और VPA साथ पूरक अन्य शर्तों के प्रत्येक के साथ पूर्व लेपित पकवान Dox / VPA साथ इलाज किया कोशिकाओं. कोशिकाओं को हर दिन की भरपाई ESC ताजा Dox और VPA साथ पूरक मध्यम के साथ. ESC की तरह कालोनियों को उपचार / DOX VPA में 7 दिनों के बाद और ~ DOX अकेले उपचार में 10 दिनों के बाद दिखाई शुरू करना चाहिए. नहीं कालोनियों DOX उपचार के अभाव में दिखाई देनी चाहिए. एक बार कालोनियों एक उज्ज्वल अपवर्तक अधिकारी, अच्छी तरह से परिभाषित सीमा और 30-50 सेल होते हैं, स्वयं एक जेल लोड विंदुक टिप और U नीचे 0 के 20 μl 96 अच्छी तरह से युक्त थाली हस्तांतरण के साथ कालोनियों को अलग.25% Trypsin – EDTA. एकल कक्षों Trypsinize और एक फ्लैट नीचे 96 150 μl ESC Dox / VPA या Dox अकेले युक्त मध्यम में अच्छी तरह से थाली में भक्षण करने के लिए स्थानांतरण. जारी करने के लिए clonally ESC मध्यम में पृथक iPSC भक्षण पर लाइनों का विस्तार. उनके अलावा (के बाद पारगमन 23 दिन) के बाद 19 दिन पर Dox और VPA निकालें. IPSC लाइनों है कि आत्म नवीकरण या प्रसार ESC नियंत्रण करने के लिए इसी तरह की दर बनाए रखने नहीं त्यागें. यह मददगार होगा ESCs के संबंध में टीईसी प्रदर्शन करने का प्रयास करने से पहले अपने iPSC लाइनों विशेषताएँ सकता है. हम 1 से हमारे लाइनों की विशेषता है) अंतर्जात immunocytochemistry, 2 द्वारा pluripotency मार्कर (-1 SSEA, Oct4, Sox2, Nanog)) गुणसूत्र गिनती द्वारा कुपोषण विश्लेषण और) 3 embryoid शरीर निर्माण की अभिव्यक्ति है. एक भी पुष्टि करने के लिए lentiviral विशिष्ट RT-qPCR कि proviral transgenes iPSCs में नहीं व्यक्त कर रहे हैं प्रदर्शन कर सकते हैं. हालांकि, हम पूरी तरह से pluripotent iPSCs की पहचान की है केवल आकारिकी immunostaining, और karyotyp का उपयोगआईएनजी. हमारे प्रयोगों में, ESC की तरह है और pluripotency मार्करों व्यक्त लाइनों के बहुमत में morphology विकास विशेषताओं के परिणाम पर आधारित iPSC लाइनों का चयन जब तक हम को आमतौर पर संभावित असामान्य karyotypes के साथ कई लाइनों की पहचान. 4. IPSCs ब्लास्टोसिस्ट इंजेक्शन के लिए तैयार एक पीएससी लाइन के मार्ग संख्या के लिए अपने pluripotency 18 प्रभावित हालांकि इस लाइन निर्भर 19 हो सकता है दिखाया गया है. हम iPSCs के 8-14 मार्ग से इस्तेमाल किया है वयस्क चूहों सभी iPSC उत्पादन. Thaw iPSCs और ESC मध्यम में भक्षण पर थाली. पारित होने भक्षण पर इंजेक्शन के लिए उपयोग करने से पहले कम से कम एक बार कोशिकाओं. अच्छी तरह से एक 6-अच्छी तरह से 70-80% सहधारा iPSCs युक्त थाली के एक इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं के एक पर्याप्त संख्या की तुलना में अधिक प्रदान करेगा. मध्यम विकास Aspirate और ~ 3 मिलीलीटर 1x पीबीएस (2 Ca + मिलीग्राम / 2 + के बिना) के साथ कोशिकाओं धोने. 0.5 मिलीलीटर पूर्व गर्म 0.05% ट्रिप्सिन-EDTA जोड़ेंकोशिकाओं और सामयिक कमाल के साथ 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते. एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्त महीन चुर्ण बनाना. प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए एक एकल कक्ष निलंबन को सुनिश्चित करने के लिए. iPSCs एकल कक्ष निलंबन में कालोनियों / सेल समुच्चय के रूप में इंजेक्शन विंदुक रोकना होगा की जरूरत है. एक बार एक एकल कक्ष निलंबन बेन हासिल किया है, अच्छी तरह से करने के लिए 1.0 मिलीलीटर ESC मीडिया जोड़ने और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली वापसी. ~ 15 मिनट के लिए सेते हैं या जब तक भक्षण के बहुमत का पालन शुरू कर दिया है. धीरे से देखभाल करने के लिए कमजोर पक्षपाती भक्षण नहीं स्थानच्युत करना iPSCs युक्त मध्यम हटा दें. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार 5 मिलीलीटर ESC मध्यम युक्त ट्यूब में iPSCs रखें. 5 मिनट के लिए 200 XG अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला Aspirate और एक micropipette साथ ES सेल मध्यम के शेष को हटा. ट्यूब ठोकर 0.2-0.5 मिलीग्राम FHM पूर्व ठंडा मध्यम में गोली और धीरे resuspend कोशिकाओं स्थानच्युत करना. बर्फ पर स्टोर जब तक और टेट्राप्लोइड ख में इंजेक्शन के दौरान कोशिकाओंlastocysts. 5. टेट्राप्लोइड blastocysts की पीढ़ी इस खंड में प्रदर्शन प्रक्रियाओं कहीं और 5,6,20 विस्तार में वर्णित किया गया है. यहाँ हम हमारी तकनीक, BTX इलेक्ट्रो सेल मैनीपुलेटर 2001 ईसीएम के लिए अनुकूलित रूपरेखा. भड़काना पीएमएस और एचसीजी के साथ 23-28 दिन पुराने मादा चूहों (ग – 2j C57BL/6J-Tyr / / BALB cByJ F1) द्वारा भ्रूण दाता चूहों सेट. 14:00 और 5 आइयू एचसीजी 47 घंटा के पीएमएस के 5 आइयू बाद प्रशासन. एचसीजी इंजेक्शन के बाद, ग – 2j C57BL/6J-Tyr / / BALB cByJ F1 संवर्धन पुरुषों के साथ मादा चूहों सेट. योनि प्लग के लिए अगले दिन की जाँच करें. Euthanize मादा चूहों खामियों को दूर किया और oviducts इकट्ठा. Hyaluronidase साथ FHM में oviducts रखने और धीरे ampulae फाड़ 1 सेल भ्रूण ले लीजिए. मेघपुंज जनता / FHM hyaluronidase में 5-7 मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति दें. 1-सेल एक मुँह विंदुक का उपयोग भ्रूण एकत्र और उन्हें KSOM में रखने से पहले FHM मीडिया की बूंदों के माध्यम से धोसंस्कृति ए.ए.. 37 पर संस्कृति डिग्री सेल्सियस, रातोंरात खनिज तेल के तहत 5% सीओ 2 और 2 सेल भ्रूण electrofusion के दिन का चयन करने के लिए, अन्य सभी भ्रूण को त्यागें. एक 10 सेमी पेट्री डिश में एक BTX Microslide रखें. डूब के लिए पर्याप्त कमरे के तापमान electrofusion मीडिया डालो स्लाइड समाधान में है, लेकिन है कि इलेक्ट्रोड के डंडे नहीं इतना पूरी तरह से डूबे हुए हैं. 2001 ECM और BTX 400 बढ़ाने पर स्विच. ECM microslide इलेक्ट्रोड केबल कनेक्ट और पेट्री डिश की ओर करने के लिए केबल को ठीक करने के लिए स्लाइड के अनपेक्षित आंदोलन को रोकने के. एक पुस्तिका नाड़ी भागो BTX बढ़ाने पर पढ़ पाने के लिए और एसी / डीसी लागू किया जा रहा धाराओं के वोल्टेज ध्यान दें. एसी चालू गति, जिस पर भ्रूण इलेक्ट्रोड के बीच पंक्ति में होगा नियंत्रण होगा, वर्तमान डीसी blastomeres फ्यूज, और नाड़ी समय डीसी नाड़ी की लंबाई निर्धारित होगा. एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु एसी 3V, डीसी 100V, और समय मिसे 0.05 है. इष्टतम डीसी 90-150 वोल्ट की रेंज में बदलता है. </li> एक मुंह विंदुक का प्रयोग, KSOM ए.ए. संस्कृति से 30-40 दो सेल भ्रूण के बारे में लेने के लिए और उन्हें electrofusion माध्यम के कई बूंदों के माध्यम से धो. मुंह विंदुक में microslide पकवान से ताजा electrofusion मीडिया ड्रा और धोने से भ्रूण ले. उन्हें 1 मिमी microslide पर इलेक्ट्रोड के बीच अंतराल में रखें. सावधान कि वे अंतराल के बीच नीचे गठबंधन कर रहे हैं और वे एक दूसरे के साथ संपर्क में नहीं हैं कि. एसी चालू पुस्तिका पल्स बटन दबाने से लागू करें. भ्रूण एसी क्षेत्र में घुमाने के लिए, तक ब्लास्टोमीयर संपर्क के विमान इलेक्ट्रोड के समानांतर है. यदि भ्रूण कुछ ही सेकंड में नहीं जुड़ रहे हैं, एसी सेटिंग में वृद्धि हुई है. बाद भ्रूण गठबंधन किया है, मैनुअल नाड़ी बटन फिर प्रेस डीसी नाड़ी लागू. विंदुक में electrofusion माध्यम के साथ, microslide से भ्रूण इकट्ठा. ए.ए. KSOM के कई बूंदों के माध्यम से भ्रूण धो और KSOM ए.ए. संस्कृति में उन्हें 37 में जगह ° सी, 5% सीओ 2. ब्लास्टोमीयर संलयन थानेदारसंस्कृति में कम से कम 30 मिनट में पूरा किया जा uld. दोहराएँ शेष 2 सेल भ्रूण के लिए 7-11 कदम. बाद संलयन समूहों के बाद निगरानी, ​​और जुड़े blastomeres के साथ भ्रूण का चयन करें. सफलतापूर्वक में जुड़े हुए भ्रूण 1 कोशिका चरण में दिखाई देगा. संस्कृति में 30 मिनट के बाद lysed और 2-सेल भ्रूण त्यागें. यदि संलयन दर 80% से नीचे, 5V और मिसे 0.01 की वेतन वृद्धि में वोल्टेज और / या समय में वृद्धि हुई है. यदि lysis 20% से ऊपर है, डीसी वोल्टेज और / या समय के अनुसार कम. हमारे प्रयोगों में इष्टतम सेटिंग्स एसी 4V, डीसी 146V, और 0.07 मिसे थे. ये सेटिंग्स लगातार 90% या अधिक कम या कोई lysis के साथ विलय की दर झुकेंगे. 37 KSOM ए.ए. खनिज तेल के तहत microdrops में जुड़े भ्रूण संस्कृति डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 के लिए आगे बढ़ें. आप जुड़े भ्रूण की 85-95% की उम्मीद ऊष्मायन के 48 घंटे के बाद टेट्राप्लोइड blastocysts (4N) के रूप में करना चाहिए. 6. IPSCs की टेट्राप्लोइड blastocysts में microinjection हम एक ते 2000U Nikon का उपयोग करेंऔंधा माइक्रोस्कोप डीआईसी ब्लास्टोसिस्ट इंजेक्शन के लिए और प्रकाशिकी Narishige micromanipulators साथ सुसज्जित. प्रत्येक टेट्राप्लोइड ब्लास्टोसिस्ट 10-12 माउस blastocysts में ESC इंजेक्शन के लिए एक मानक प्रोटोकॉल का उपयोग iPSCs कि पिछले एक जौव 5,20,21 प्रकाशन में प्रदर्शन किया गया है इंजेक्शन के साथ एक अवतल खुर्दबीन स्लाइड के केंद्र में एक 20 FHM के μl ड्रॉप प्लेस और यह खनिज तेल के 150 μl के साथ कवर. कम पकड़ और FHM ड्रॉप में microinjection सुई विंदुक. आंशिक रूप से FHM के साथ भरने के लिए दोनों सुइयों के लिए 2-3 मिनट की अनुमति दें. खुर्दबीन स्लाइड पर FHM ड्रॉप FHM और हस्तांतरण की बूंदों के माध्यम से 20-30 टेट्राप्लोइड blastocysts धोयें. बूंद में मुँह विंदुक iPSC मिश्रण. यह पहले अगर कोशिकाओं को भी ध्यान केंद्रित कर रहे हैं या एकत्रित FHM की एक बूंद में सेल के मिश्रण को कमजोर करने के लिए आवश्यक हो सकता है. इंजेक्शन की सुई के साथ 100-200 कोशिकाओं उठाओ. आंतरिक कोशिका द्रव्यमान के साथ 9 बजे मंज़ूर में ब्लास्टोसिस्ट पकड़ोआयन. Blastocoel में 3 बजे की स्थिति पर zona pellucida और ट्रोफोब्लास्ट मर्मज्ञ द्वारा कोशिकाओं इंजेक्षन. ब्लास्टोसिस्ट प्रति 16-18 कोशिकाओं इंजेक्षन. IPSC पूरित blastocysts KSOM ए.ए. संस्कृति लौटें. 7. प्राप्तकर्ता चूहों के गर्भाशय हार्न्स में पूरित टेट्राप्लोइड blastocysts का स्थानांतरण पूरित टेट्राप्लोइड blastocysts शल्य चिकित्सा शोधकर्ता संस्थान के दिशा निर्देशों के अनुसार महिला प्राप्तकर्ता चूहों के गर्भाशय सींग के लिए तबादला कर दिया, मानक 20 तकनीक का उपयोग कर जो हम संक्षेप में संक्षेप में प्रस्तुत करना होगा. चरण समर्थक कामोंमाद में महिला चूहों सीडी-1 का चयन करें और उन्हें vasectomized पुरुषों के साथ संभोग के लिए सेट अप. योनि प्लग के लिए अगली सुबह की जाँच करें. महिलाओं गर्भाशय भ्रूण स्थानांतरण दो दिन के बाद प्लग (2.5 डीपीसी) का पता चला था के लिए तैयार कर रहे हैं. एक दिन पहले प्राप्तकर्ता महिलाओं vasectomized पुरुषों के साथ mated रहे हैं, अतिरिक्त CD-1 गैर – vasectomized पुरुषों के साथ महिलाओं सेटसभी iPSC निरंकुश अनुभाग द्वारा प्राप्त चूहों के लिए पालक मां के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा. 8. सीजेरियन और iPSC व्युत्पन्न पिल्ले की धारा को बढ़ावा टीसी भ्रूण के हस्तांतरण आरोपण के बाद कई resorptions में आमतौर पर परिणाम है, यहां तक ​​कि अगर iPSC या ESC लाइन एक उच्च विकास क्षमता है. एक परिणाम के रूप में, एक अधिक से अधिक 4 प्राप्तकर्ता प्रति व्यवहार्य पिल्ले (1-2 आमतौर पर) की उम्मीद कर सकते हैं. आमतौर पर इन छोटे litters प्राप्तकर्ताओं द्वारा उपेक्षित रहे हैं. नवजात देखभाल और जीवित रहने की दर के स्तर को बढ़ाने के लिए, हम सीजेरियन प्रदर्शन और मानक 20 प्रोटोकॉल के अनुसार बढ़ावा देने. सीजेरियन सेक्शन प्रदर्शन करने के लिए, 7 8:00 (प्राप्तकर्ता 18.5 डीपीसी) में भ्रूण स्थानांतरण के बाद 16 दिनों के प्राप्तकर्ता चूहों और euthanize गर्भाशय सींग से पिल्ले टुकड़े करना. सीडी 1 वितरित litters कि उसी दिन माताओं व्यवहार्य पिल्ले को बढ़ावा.

Representative Results

In step 3, “Derivation of iPSCs from MEFs”, one should observe morphological heterogeneity and immature iPSC colony formation starting 4-5 days after doxycycline/VPA addition and mature colonies between 7-10 days (Figure 2). The production of one-cell tetraploid embryos in step 5 is highly efficient (Figure 3). We routinely observe up to 95% of treated two-cell embryos successfully fuse to produce tetraploid one-cell embryos. The protocol followed to inject iPSCs into tetraploid blastocysts (Step 6, Figure 4) is similar to the protocol for injection of ESCs into diploid blastocysts to generate chimeric mice, and can be performed by an experienced microinjectionist. The number of live pups born depends on the cell line (Table 1). MEF preprogramming efficiency 0.01-0.03% Efficiency of iPSC mouse production by TEC Name Description Blastocysts injected Live Newborn Live Adult iMZ-21 iPSC 867 53 (6.1%) 19 (2.2%) iMZ-9 iPSC 195 7 (3.6%) 4 (2.1%) iMZ-11 iPSC 338 1(0.3%) 0 (0%) Table 1. Representative Results. Figure 1. Schematic of experimental design. Top left: Production of tetraploid blastocysts. Fertilized two-cell embryos from albino mice are electrofused to generate tetraploid one-cell embryos, which are cultured in vitro to the blastocyst stage. Bottom left: Reprogramming. Mouse embryonic fibroblasts are transduced with lentiviral particles encoding Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc and the reverse tetracycline transactivating protein, rtTAM2.2. Addition of doxycycline results in transgene expression and the initiation of reprogramming to iPSCs. Right: Production of iPSC mice. iPSCs derived from pigmented mice are injected into the blastocoel of tetraploid blastocysts and then surgically implanted into pseudo-pregnant recipient mice. Newborn iPSC mice are delivered by Caesarian section and cross-fostered. Click here to view larger figure. Figure 2. Morphological changes associated with reprogramming. From left to right: Examples of the morphological progression from fibroblasts to iPSC colonies during the course of a reprogramming experiment. Click here to view larger figure. Figure 3. Production of tetraploid embryos. Diploid two-cell embryos are subjected to an electric pulse resulting in blastomere fusion and generation of one-cell tetraploid embryos. Figure 4. Production of iPSC mice. Left: iPSCs are injected into the blastocoel of a tetraploid blastocyst. Middle: Newborn iPSC mice are distinguished by pigmented eyes. Right: iPSC mouse at three weeks post-delivery.

Discussion

IPSC TEC assays का उपयोग कर लाइनों से जनरेटिंग चूहों pluripotency के लिए एक iPSC लाइन के एक कड़े कार्यात्मक परीक्षण प्रदान करता है. इस परीक्षण के विभिन्न तरीकों में से एक reprogramming रिश्तेदार प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए या iPSC लाइनों है कि इन विट्रो में कुछ सेल प्रकार पैदा करने के लिए सबसे उपयोगी हो सकता है की पहचान करने के लिए उपयोगी हो सकता है. IPSCs से उत्पन्न चूहे इसरो दीर्घकालिक स्थिरता और iPSC व्युत्पन्न ऊतकों के tumorigenicity का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल करने के लिए पूरी तरह से pluripotent iPSC लाइनों या iPSC चूहों उत्पन्न या reprogramming विभिन्न तरीकों में से एक रिश्तेदार उपयोगिता की तुलना करने के इच्छुक जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी होगा.

तंत्र है कि पीढ़ी और पूरी तरह से pluripotent iPSCs के पहचान नियंत्रण खराब समझा रहते हैं और यह संभव है कि कुछ iPSC लाइनों का उत्पादन इस पद्धति का उपयोग करके TEC परीक्षण पारित नहीं होगा. कई कारकों आनुवंशिक पृष्ठभूमि, lentiviral अनुमापांक, lentiviral मैं पैटर्न सहित प्रयोगों के बीच भिन्न हो सकते हैंnsertion, सेल दाता आबादी के चक्र मापदंडों, टीईसी प्रक्रिया के विभिन्न चरणों और iPSCs के चर propensities में अंतर – प्रयोगशाला मतभेद आनुवंशिक या epigenetic aberrations बंदरगाह. सबसे अच्छी सफलता सुनिश्चित करने के लिए, हम देखभाल करने के लिए नियंत्रण MEFs पर वायरल dilutions का परीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रत्येक वायरस पर्याप्त detectable जीन की अभिव्यक्ति कम से कम 80% और आदर्श 100% का उत्पादन करने के लिए केंद्रित है iPSC व्युत्पत्ति प्रयोगों में lentiviral जीन अभिव्यक्ति के उचित स्तर की स्थापना MEFs. यह हमें अलग lentiviruses के कई प्रतियों के साथ लाइनों की पहचान करने के लिए जबकि MEFs के लिए सीमित विषाक्तता और भीड़भाड़ कुओं के बिना कालोनियों का निर्माण करने की अनुमति देता है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कई अन्य प्रोटोकॉल पूर्ण विकास क्षमता के साथ उत्पादन iPSCs, कई तरीकों और दाता सेल के सूत्रों सुझाव है कि पूर्ण pluripotency के लिए कई पथ ^1,8-13,15 मौजूद हो सकता है का उपयोग करते हुए दिखाया गया है. वर्तमान में, तथापि, का कोई निश्चित biomarker पूरी तरह pluripotent iPSCपहचान की गई इसलिए TEC परख कि एक iPSC लाइन एक जीव में सभी सेल प्रजातियों उत्पन्न कर सकते हैं सोने के मानक परीक्षण बनी हुई है.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM (high glucose)	Invitrogen	11965-092
ES cell qualified FBS	Invitrogen	104392-024
FBS	Invitrogen	16140-071
Glutamax	Invitrogen	35050-061
β-Mercaptoethanol	Sigma	Sigma M7522
0.1% Gelatin	Millipore	ES006-B
MEM Non-Essential Amino Acids	Invitrogen	11140
Medium 199	Invitrogen	11150-059
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
ESGRO (murine LIF)	Millipore	ESG1106
Valproic Acid	Sigma	P4543
DMSO	Fisher	BP231-100
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200
PBS Ca2+/Mg2+	Invitrogen	14040-133
PBS Ca2+/Mg2+ free	Invitrogen	14190-144
Pregnant mare serum gonadotropin, for superovulation, freeze-dried, 2,000 IU	Harbor-UCLA Research Institute	n/a
Chorionic gonadotropin, human	Sigma	C1063
FHM medium with Hyaluronidase	Millipore	MR-056-F
KSOM-1/2 AA medium	Millipore	MR-106-D
FHM	Millipore	MR-024-D
Water, for embryo transfer, embryo tested	Sigma	W1503
Mineral oil, embryo tested	Sigma	M5310
CaCl2	Sigma	C7902
MgSO4	Sigma	M2773
D-Mannitol	Sigma	M4125
Bovine serum albumin (BSA), embryo tested	Sigma	A3311
Mouse embryonic fibroblasts, non-irradiated	Millipore	PMEF-CFL
			Media and buffers used in this protocol HEK293T growth medium. 90% DMEM, 10% FBS, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. Exclude penicillin and streptomycin from HEK media used on day of transfection. HEK medium can be stored at 4 °C for up to 1 month. 2x HBS. 42 mM Hepes, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.5 mM Na2HPO4·7H2O, 12 mM Dextrose. pH to 7.1 +/- 0.1. pH is critical! Sterile filter and store at 4 °C. Mouse embryonic fibroblast (MEF) growth medium (also for use with feeders). 70% DMEM, 20% Medium 199, 10% FBS, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. Store at 4 °C for up to 1 month. ESC growth medium. 85% DMEM,15% ES cell qualified FBS, 1x Glutamax, 0.1 mM non-essential amino acids, 0.1 mM β-mercaptoethanol, 1,000 U/ml ESGRO, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. ESC media can be stored at 4 °C for up to three weeks. Electrofusion medium. 0.3 M Mannitol, 0.1 mM MgSO4, 50 mM CaCl2, and 3% BSA in embryo tested water. Store at 4 °C for up to 3 months.