एक के रूप में एक अमर murine मस्तिष्क Microvascular Endothelial सेल लाइन का सृजन<em> इन विट्रो में</em> रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल
Summary
इस विधि का वर्णन कैसे अलग करने के लिए माउस मस्तिष्क से microvascular endothelial कोशिकाओं अमर. हम एक कदम दर कदम मस्तिष्क के ऊतकों, पाचन कदम, बोने और कोशिकाओं के स्थायीकरण के homogenization से शुरू प्रोटोकॉल का वर्णन. आमतौर पर, यह लगभग पाँच सप्ताह लगते हैं एक समरूप, अमर microvascular endothelial सेल लाइन प्राप्त करने के.
Abstract
Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the Förster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.
Protocol
Discussion
वर्णित प्रक्रिया microvascular के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अलग दस्तक बाहर माउस उपभेदों से अलग माउस उपभेदों से ईसीएस संवहनी endothelium समारोह में विशिष्ट परिवर्तन का अध्ययन. स्थायीकरण की एक विधि के रूप में हम murine polyomavirus, Polyoma बीच टी प्रतिजन की oncoprotein के साथ परिवर्तन किया. यह तेजी से vivo में और 20,21,22 इन विट्रो में अपरिपक्व endothelial कोशिकाओं को बदल देती है. ईसीएस के स्थायीकरण के अन्य तरीकों साहित्य में वर्णित उदाहरण के लिए SV40 सिमीयन Vacuolating वायरस की एक बड़ी टी प्रतिजन 40 23, adenovirus जीन उत्पाद 24 E1A या मानव 3 टेलोमिरेज का उत्प्रेरक सबयूनिट की overexpression के साथ अमरता शामिल हैं. साथ अमरता PymT murine अपरिपक्व ईसीएस, जो एक कम समय में नवजात चूहों से एक समरूप ईसी संस्कृति प्राप्त करने की अनुमति देता है के लिए विशिष्ट है. स्थायीकरण कोशिकाओं और वें के गुणों में परिवर्तनई अमर कोशिका लाइनों के साथ प्राप्त परिणामों प्राथमिक कोशिकाओं के साथ या चूहों के साथ vivo में प्रयोगों के साथ भी तुलना चाहिए. PymT अमर ईसी fibrinolytic गतिविधि का उच्च स्तर Urokinase प्रकार plasminogen उत्प्रेरक के उत्पादन में वृद्धि से उत्पन्न व्यक्त वर्णित किया गया है, और plasminogen उत्प्रेरक 25 inhibitors के उत्पादन में कमी. PymT की प्रत्यक्ष तुलना अमर bEND5 प्राथमिक के साथ सेल लाइन ईसीएस से पता चला है कि दोनों इन विट्रो BBB मॉडल में अच्छी तरह से टी कोशिका आसंजन 26 के अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं.
सेल स्थापित वर्णित प्रक्रिया के अनुसार लाइनों कम बीतने के नंबर पर इस्तेमाल किया जा सकता है BBB और चुनाव आयोग junctional प्रोटीन की उच्च अभिव्यक्ति द्वारा बाधा गुण को बनाए रखने के लिए, के रूप में कोशिकाओं की उम्र बढ़ने के दौरान इन गुणों खो. इस प्रकार गुण बाधा नुकसान के बाद, एक नया सेल लाइन की तैयारी पर विचार किया जाना चाहिए. सेल चढ़ाना घनत्व ईसीएस के लिए उच्च हो सकता है, के रूप में इस सेल प्रसार के लिए महत्वपूर्ण है. इस अलगाव की प्रक्रिया के दौरान अमर ईसीएस के रखरखाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विचार किया जाना चाहिए. प्रत्येक नया सेल लाइन अपने गुण बाधा के लिए और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ संभव contaminants के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. चुनाव आयोग monolayers विरोधी galactocerebroside, विरोधी glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन और विरोधी चिकनी प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप पेशी प्रतिजन के साथ कलंकित किया जा सकता oligodendrocytes astrocytes, और 4,27 pericytes साथ प्रदूषण को बाहर. करने के लिए बाहर meningal vasculature द्वारा संदूषण शासन, की अभिव्यक्ति thrombomodulin, परीक्षण किया जा सकता है जो 28 मस्तिष्क के अपवाद के साथ सभी संवहनी बेड में व्यक्त किया है.
दिलचस्प है, अमर microvascular endothelial सेल अलग मस्तिष्क क्षेत्रों से अलग लाइनों उनके गुण बाधा और संवेदनशीलता में समर्थक भड़काऊ उत्तेजनाओं को अलग. एक उदाहरण के रूप में, मस्तिष्क cEND और अनुमस्तिष्क cerebEND सेल लाइनों 4,5 उल्लेख किया जा सकता है. CerebEND तुलना में पता चला है,cEND, कम प्रमुख तंग जंक्शन claudin-1 और occludin घटकों की अभिव्यक्ति के स्तर. हालांकि, claudin-3 और -12 के स्तर cerebEND में अधिक थे. cerebEND कोशिकाओं की बाधा समारोह भड़काऊ मध्यस्थ के साथ एक इलाज है, की तुलना में cEND कोशिकाओं संपत्तियों की बाधा 5 किया TNFα के तहत बहुत अधिक का सामना करना पड़ा. हायर अनुमस्तिष्क भड़काऊ उत्तेजनाओं के लिए जोखिम, एकाधिक काठिन्य रोगियों में और 29 encephalomyelitis autoimmune पशु मॉडल प्रयोगात्मक में vivo में देखा जा सकता है. ये दिलचस्प निष्कर्ष पैदा करने और इन विट्रो मॉडल में अलग मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए व्यक्तिगत निस्र्पक क्रम में भविष्य दवा मस्तिष्क में लक्ष्यीकरण में सुधार की आवश्यकता को दिखाते हैं.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ड्यूश Forschungsgemeinschaft DFG द्वारा अनुदान संख्या एफओ 315/4-1 और DFG SFB 688 के तहत इस शोध का समर्थन किया गया था.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Purity > 98% |
| collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | 50 μg/ml in 50 mM acetic acid |
| Collagenase/ Dispase | Roche | 10269638001 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) |
| L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C |
| MEM Vitamine | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C |
| Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | |
| Neomycin (G418) | PAA Laboratories | P11-012 | |
| Non essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom AG | L1825 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 0.8 mg/ml in PBS, storage at -20 °C |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom AG | L1825 | 0.05%, 0.02% EDTA in PBS |
References
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