Denna metod beskriver hur man isolera och odödliggöra mikrovaskulära endotelceller från mus hjärna. Vi beskriver ett steg-för-steg-protokoll utgående från homogenisering av hjärnvävnaden, steg matsmältning, sådd och immortalisering av cellerna. Vanligtvis tar det cirka fem veckor att få en homogen, förevigat mikrovaskulär endotelceller linje.
Epitel-och endotelceller (EG) bygger paracellulära barriärer som skyddar vävnad från yttre och inre miljö. Blod-hjärnbarriären (BBB) som består av EG astrocyt end-fötter, pericyter och basala membranet är ansvarig för att skydda och homeostas av hjärnparenkymet. In vitro BBB modeller är gemensamma verktyg för att studera struktur och funktion BBB på cellnivå. Ett stort antal olika in vitro BBB modeller har fastställts för forskning i olika laboratorier hittills. Vanligtvis är cellerna erhållna från nötkreatur, svin, råtta eller mus hjärnvävnad (diskuteras i detalj i översikten av Wilhelm et al. 1). Mänskliga vävnadsprover finns endast i ett begränsat antal laboratorier eller företag 2,3. Medan primära cellpreparat är tidskrävande och EG kulturer kan skilja sig från parti till parti, inrättandet av odödliggjorda EG lines är i fokus för vetenskapligt intresse.
Här presenterar vi en metod för att fastställa en odödlig hjärna mikrovaskulära EG linje från neonatal mus hjärna. Vi beskriver proceduren steg för steg lista de reagenser och lösningar som används. Den metod som inrättas genom vårt labb tillåter isolering av en odödlig homogen endotelial cellinje inom 4-5 veckor. Hjärnan mikrovaskulära endotelceller cellinjer benämns cEND 4 (från hjärnbarken) och cerebEND 5 (från cerebellar cortex), isolerades enligt detta förfarande i Förster laboratoriet och har faktiskt använts för förklaring av olika fysiologiska och patologiska processer i BBB. Använda cEND och cerebEND vi har visat att dessa celler svarar på glukokortikoid-4,6-9 och östrogen behandling 10 samt till pro-infammatory mediatorer, såsom TNFalpha 5,8. Dessutom har vi studerat patologi multipel SClerosis 11 och hypoxi 12,13 på EG-nivå. Den cEND och linjer cerebEND kan betraktas som ett bra verktyg för att studera struktur och funktion av BBB, cellulära svaren av ECS till olika stimuli eller samverkan mellan EG med lymfocyter eller cancerceller.
Det beskrivna förfarandet kan användas för isolering av mikrovaskulära ECS från olika musstammar samt från olika knock-out musstammar att studera specifika förändringar i vaskulärt endotel funktion. Som en metod för immortalisering vi använde transformation med onkoprotein av murint polyomavirus, Polyoma mellersta T-antigen. Det omvandlar snabbt omogna endotelceller in vivo och in vitro 20,21,22. Andra metoder för odödliggörande av EC beskrivna i litteraturen innefattar exempelvis immortalisering med SV40 stort T-antigen av Simian Virus vakuoliserande 40 23, adenovirus genprodukt E1A 24 eller överuttryck av den katalytiska subenheten av humant telomeras 3. Det immortalisering med PymT är specifik för den murina omogna EC, som gör det möjligt att få en homogen EG kultur från neonatala möss i en kort tid. Immortalisering förändrar egenskaperna hos cellerna och the resultat som erhållits med odödliga cellinjer ska jämföras antingen med primära celler eller med experiment in vivo med möss. PymT förevigat EG har beskrivits för att uttrycka höga nivåer av fibrinolytisk aktivitet till följd av ökad produktion av urokinastyp plasminogenaktivator och minskad produktion av plasminogenaktivator-hämmare 25. Direkt jämförelse av PymT immortaliserad bEND5 cellinjen med primär ECS avslöjade att både in vitro-modeller BBB väl lämpade för T-studier cell adhesion 26.
De cellinjer som fastställts i enlighet med det beskrivna förfarandet kan användas vid låg passage nummer för att upprätthålla barriäregenskaper genom hög expression av BBB och EG Junktional proteiner som cellerna förlorar dessa egenskaper under åldrandet. Sålunda efter förlust av barriäregenskaper, bör beredning av en ny cellinje övervägas. Cell plätering densitet bör vara hög för ECS, eftersom detta är avgörande för celltillväxt. Detta måste beaktas vid isoleringsförfarandet samt underhåll av förevigade ECS. Varje ny cellinje bör testas för dess barriäregenskaper och för eventuella föroreningar med andra celltyper. EG monoskikt kan färgas med anti-galaktocerebrosid, anti-gliafibrillärt surt protein och anti-glatt muskulatur antigen som primära antikroppar för att utesluta förorening med oligodendrocyter, astrocyter och pericyter 4,27. För att utesluta förorening med meningal vaskulatur, kan expressionen av trombomodulin testas, som uttrycks i alla vaskulära bäddar med undantag av hjärnan 28.
Intressant de odödliggjorda mikrovaskulära endotelceller cellinjer som isolerats från olika hjärnregioner skiljer sig åt i barriäregenskaper och känslighet för pro-inflammatoriska stimuli. Som ett exempel, kan de cerebrala cEND och cerebellär cerebEND cellinjer nämnas 4,5. CerebEND visade, i jämförelseatt cEND, lägre uttrycksnivåer av större snäva junction komponenter Claudin-1 och occludin. Emellertid var nivåerna av Claudin-3 och -12 högre cerebEND. Den barriärfunktion cerebEND celler lidit mycket mer under en behandling med inflammatorisk mediator, TNFa än barriäregenskaper cEND celler gjorde 5. Högre cerebellär sårbarhet för inflammatoriska stimuli, kan observeras in vivo i patienter med multipel skleros och i sin djurmodell experimentell autoimmun encefalomyelit 29. Dessa intressanta resultat visar behovet av generering och karakterisera individ in vitro-modeller för olika hjärnregioner, för att förbättra den framtida målsökande in i hjärnan.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG enligt licensnummer FO 315/4-1 och DFG SFB 688.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Purity > 98% |
collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | 50 μg/ml in 50 mM acetic acid |
Collagenase/ Dispase | Roche | 10269638001 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) |
L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C |
MEM Vitamine | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C |
Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | |
Neomycin (G418) | PAA Laboratories | P11-012 | |
Non essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C |
Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C |
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom AG | L1825 | |
Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 0.8 mg/ml in PBS, storage at -20 °C |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Trypsin/EDTA | Biochrom AG | L1825 | 0.05%, 0.02% EDTA in PBS |