आसंजन पर निर्भर कम तीव्रता अल्ट्रासाउंड का उपयोग सिग्नल की प्रेरण

Summary

इस प्रोटोकॉल स्पंदित कम तीव्रता अल्ट्रासाउंड है, जो फोकल आसंजन गठन और transmembrane मैट्रिक्स रिसेप्टर, syndecan-4 की सगाई की नकल उतार द्वारा Rac1 सक्रियण ड्राइव के साथ सुसंस्कृत fibroblasts की उत्तेजना का वर्णन करता है. इस दृष्टिकोण सेलुलर स्तर पर एक सफल नैदानिक ​​तकनीक की जांच की अनुमति देता है, जिससे चिकित्सा के शोधन के लिए अवसर प्रदान.

Abstract

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from regulation of cell migration and proliferation, to secretion and even differentiation. The signals underlying each of these complex processes arise from the molecular interactions of extracellular matrix receptors on the surface of the cell. Integrins are the prototypic receptors and provide a mechanical link between extracellular matrix and the cytoskeleton, as well as initiating some of the adhesion-dependent signaling cascades. However, it is becoming increasingly apparent that additional transmembrane receptors function alongside the integrins to regulate both the integrin itself and signals downstream. The most elegant of these examples is the transmembrane proteoglycan, syndecan-4, which cooperates with α₅β₁-integrin during adhesion to fibronectin. In vivo models demonstrate the importance of syndecan-4 signaling, as syndecan-4-knockout mice exhibit healing retardation due to inefficient fibroblast migration^1,2. In wild-type animals, migration of fibroblasts toward a wound is triggered by the appearance of fibronectin that leaks from damaged capillaries and is deposited by macrophages in injured tissue. Therefore there is great interest in discovering strategies that enhance fibronectin-dependent signaling and could accelerate repair processes.

The integrin-mediated and syndecan-4-mediated components of fibronectin-dependent signaling can be separated by stimulating cells with recombinant fibronectin fragments. Although integrin engagement is essential for cell adhesion, certain fibronectin-dependent signals are regulated by syndecan-4. Syndecan-4 activates the Rac1 protrusive signal³, causes integrin redistribution¹, triggers recruitment of cytoskeletal molecules, such as vinculin, to focal adhesions⁴, and thereby induces directional migration³. We have looked for alternative strategies for activating such signals and found that low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) can mimic the effects of syndecan-4 engagement⁵. In this protocol we describe the method by which 30 mW/cm², 1.5 MHz ultrasound, pulsed at 1 kHz (Fig. 1) can be applied to fibroblasts in culture (Fig. 2) to induce Rac1 activation and focal adhesion formation. Ultrasound stimulation is applied for a maximum of 20 minutes, as this combination of parameters has been found to be most efficacious for acceleration of clinical fracture repair⁶. The method uses recombinant fibronectin fragments to engage α₅β₁-integrin, without engagement of syndecan-4, and requires inhibition of protein synthesis by cycloheximide to block deposition of additional matrix by the fibroblasts., The positive effect of ultrasound on repair mechanisms is well documented^7,8, and by understanding the molecular effect of ultrasound in culture we should be able to refine the therapeutic technique to improve clinical outcomes.

Protocol

1. मैट्रिक्स Ligand साथ कोटिंग सतहों अल्ट्रासाउंड कोशिकाओं को 3.5 सेमी कुओं में लागू किया जाएगा या तो अलग – अलग व्यंजन के रूप में या एक 6 अच्छी तरह से थाली के रूप में,. जैव रासायनिक assays के लिए, प्लास्टिक पर सीधे कोट ligand. Immunofluorescence के लिए, कांच फोड़ा MilliQ पानी और एक अच्छी तरह से नीचे में 4 coverslips जगह में तीन बार coverslips है. ग्लास सतहों derivatized कुशल ligand कोटिंग यह सुनिश्चित करना चाहिए. 1 मिमी में पीबीएस में एस्टर sulpho मीटर – maleimidobenzoyl – एन – hydrosuccinimide भंग. एक अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं. Derivatized सतहों पीबीएस के साथ 3 बार धो लें. कोट या तो derivatized कांच या Integrin ligand के साथ अनुपचारित प्लास्टिक के. एक अच्छी तरह से 10 स्नातकीय / एमएल Integrin ligand9 के 2 मिलीग्राम, और मिलीग्राम + 2 Ca 2 युक्त पीबीएस में भंग लागू करें और 4 में रात भर सेते हैं डिग्री सेल्सियस 85 ° 13 मिनट के लिए सी 1% बीएसए, पीबीएस में भंग, हीटिंग द्वारा तैयार बीएसए monoparticulate. अनुमति देंशांत करने के लिए और फिर एक .45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं. Ligand में लिपटे सतहों पीबीएस और ब्लॉक के साथ 30 मिनट के लिए monoparticulate बीएसए के साथ 3 बार धो लें. 2. प्रकोष्ठों के तैयार प्रयोग भर में मैट्रिक्स पर्यावरण को नियंत्रित करने के लिए, प्रोटीन संश्लेषण 25 / μg मिलीलीटर cycloheximide की 80% 2 घंटे के लिए मिला हुआ fibroblasts के अलावा द्वारा अवरुद्ध किया जाना चाहिए. पीबीएस के साथ cycloheximide इलाज कोशिकाओं कुल्ला और संस्कृति 0.5 मिलीग्राम / एमएल trypsin / EDTA का उपयोग कुप्पी से अलग है. हार्वेस्ट 5 मिनट के लिए 500x जी पर centrifugation द्वारा अलग कोशिकाओं. DMEM/25 मिमी HEPES में resuspend कोशिकाओं, 25 μg / cycloheximide मिलीलीटर. निलंबन की सेल घनत्व रुधिरकोशिकामापी का उपयोग गिनती और 105 मिलीलीटर-1 के लिए पतला. 37 ° C पर 20 से सतह Integrin से ठीक पहले के लिए कोशिकाओं को सेते हैं. पीबीएस साथ ligand में लिपटे, बीएसए अवरुद्ध कुओं 3 बार कुल्ला. बीज प्रत्येक अच्छी तरह से में सेल निलंबन के 2 मिलीग्राम. एक उपसर्ग जिसका अर्थ दूसरा, भिन्न अथवा सामान्य से विचलित हो जाना हैडब्ल्यू 37 पर 2 घंटे के लिए फैल कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2. 3. अल्ट्रासाउंड उत्तेजना 37 सी. ° करने के लिए अल्ट्रासाउंड emitter के सरणी और युग्मन जेल के गर्म प्रत्येक emitter के जेल युग्मन की एक बूँद मटर के आकार लागू करें. टेस्ट कि प्रत्येक emitter के कार्यात्मक है एक अल्ट्रासाउंड सूचक डायोड डिटेक्तार का उपयोग. Emitter सरणी पर कुओं रखें. 37 के लिए सरणी लौटें डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और अनुमति के लिए 10 मिनट के लिए संतुलित करना तापमान. अल्ट्रासाउंड संकेत पर स्विच. अल्ट्रासाउंड संकेत 20 मिनट के बाद निष्क्रिय करने के लिए, चिकित्सकीय शासन की नकल उतार. यदि कम उत्तेजना समय की आवश्यकता है, प्लेटें समय अंक उचित सरणी से हटा दिया जाना चाहिए. सभी मामलों में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग प्लेटें unstimulated. 4. Immunofluorescence द्वारा फोकल आसंजन विश्लेषण फोकल आसंजन गठन के विश्लेषण के लिए, 20 मिनट अल्ट्रासाउंड संकेत लागूऔर फिर संरचनाओं एक और 40 मिनट के लिए 37 में कोशिकाओं को बनाए रखने डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 के द्वारा विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं. मीडिया महाप्राण (व्यंजन) और पीबीएस में 2 मिलीलीटर 4% paraformaldehyde के लागू करने के द्वारा कोशिकाओं को ठीक. कमरे के तापमान पर 14 मिनट के लिए सेते हैं. Paraformaldehyde महाप्राण (व्यंजन) और पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला, पीबीएस धीरे अच्छी तरह के किनारे नीचे कतरनी बलों की पीढ़ी से बचने के आवेदन है. अच्छी तरह से लिए बाद immunofluorescent धुंधला 3.5 सेमी से 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए स्थानांतरण प्रत्येक coverslip. पीबीएस में 0.5 मिलीलीटर 0.1 एम ग्लाइसिन 24 कुओं के प्रत्येक के लिए लागू करने के अवशिष्ट paraformaldehyde द्वारा बुझा लेते हैं. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं. महाप्राण (व्यंजन) ग्लाइसिन और पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला. 0.5 मिलीलीटर 0.5% पीबीएस में X-100 ट्राइटन (w / v) लागू करने के द्वारा कोशिकाओं Permeabilise. कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए सेते हैं. महाप्राण (व्यंजन) ट्राइटन X-100 और PBS के साथ तीन बार कुल्ला. 0.5 मिलीग्राम 3% (w / v) पीबीएस में बीएसए लागू करने के द्वारा ब्लॉक. 4 डी एंड रातोंरात सेते हैंजैसे, सी. दाग vinculin hVIN 1-BSA ब्लॉक में 1:400 पतला एंटीबॉडी के साथ फोकल आसंजन युक्त. कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए सेते हैं. पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला. (488 DyLight) fluorophore संयुग्मित माध्यमिक (1:200 पतला) एंटीबॉडी और TRITC संयुग्मित बीएसए ब्लॉक में phalloidin (1:200 पतला) के साथ दाग actin के लागू होते हैं. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं. Pbs, और एक बार पानी के साथ साथ तीन बार कुल्ला. एक औंधा स्थिति में गोल्ड mountant लम्बा का उपयोग कर एक गिलास स्लाइड पर माउंट. 5. खींचो नीचे परख द्वारा Rac1 सक्रियकरण की मात्रा का ठहराव Rac1 सक्रियण के विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं के लिए 37 में 20 मिनट अल्ट्रासाउंड संकेत ° सी, 5% सीओ 2 लागू है. प्रतिक्रिया समय 20 मिनट से अधिक लंबे समय तक आकलन, 20 मिनट के लिए अल्ट्रासाउंड संकेत लागू करते हैं और कोशिकाओं को बनाए रखने 37 डिग्री सेल्सियस, शेष प्रतिक्रिया विकसित करने की अनुमति के लिए 5% सीओ 2. महाप्राण (व्यंजन) मीडिया और अच्छी तरह से जगहबर्फ पर है. 2 मिलीलीटर ठंड पीबीएस और महाप्राण (व्यंजन) के साथ कुओं कुल्ला. सुनिश्चित करें किसी भी अवशिष्ट पीबीएस 1 मिनट के लिए पूरी तरह से आकांक्षा के बाद झुका कुओं को छोड़ने के द्वारा हटा दिया जाता है. अच्छी तरह से प्रति 35 μl lysis बफर (10% ग्लिसरॉल, 20 मिमी Hepes के 7.4 पीएच, 140 मिमी NaCl, 1% NP40, 0.5% सोडियम Deoxycholate के 4 मिमी EGTA, 4 मिमी EDTA, 1 × पूरा protease अवरोध करनेवाला) के साथ बर्फ पर कोशिकाओं Lyse. इस उदाहरण में, 6 कुओं समय बिंदु प्रति इस्तेमाल सेल lysate 210 μl उत्पन्न कर रहे हैं. अधिक या कम कुओं लेकिन इस्तेमाल किया जा सकता है कुल lysate मात्रा ~ 200 μl कुल चाहिए. सेल खुरचनी के साथ परिमार्जन अच्छी तरह से कोशिकाओं को पूरा सेल सुनिश्चित करने और कुओं को छोड़ 1 मिनट के लिए झुका पूल करने के लिए lysate की अनुमति. 2 मिनट के लिए एक बहुत ठंडा 1.5 मिलीलीटर microfuge (एक ही उपचार शासन से पूलिंग lysates) ट्यूब और 21000 पर स्पिन × छ 4 डिग्री सेल्सियस पर गोली सेलुलर मलबे lysate स्थानांतरण. बहुत ठंडा lysate की 180 μl स्थानांतरण 1.5 मिलीलीटर microfuge lysis बफर के 130 μl और 25 μl पाक की भरमार वाले ट्यूबोंathione agarose 10 मनकों. -20 डिग्री सेल्सियस पर बाद जेल जुदाई के लिए शेष कच्चे lysate रखें. 4 में 40 मिनट के लिए ट्यूबों rotating द्वारा पाक glutathione agarose मनकों पर सक्रिय Rac1 कैप्चर डिग्री सेल्सियस फसल agarose मनका 2000 में centrifugation द्वारा conjugates × 4 में 1 मिनट के लिए छ डिग्री सेल्सियस धो मनका 500 μl lysis बफर के साथ तीन बार conjugates, 2000x जी और discarding सतह पर तैरनेवाला पर centrifugation द्वारा प्रत्येक धोने के बाद मोती कटाई. ध्यान से एक 200 μl विंदुक के साथ किसी भी शेष सेल धो बफर हटा दें. एक मिलाते हुए गर्मी खंड पर 5 मिनट के लिए 35 μl लोड हो रहा है एसडीएस पृष्ठ बफर और 85 में सेते हैं डिग्री सेल्सियस जोड़कर प्रत्येक नमूना Elute के. 21,000 × छ पर centrifugation द्वारा 1 मिनट के लिए मोती निकालें. एसडीएस पृष्ठ मनका प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक को हल करने के nitrocellulose और Rac1 के लिए जांच करने के लिए स्थानांतरण. 6. प्रतिनिधि परिणाम इस प्रोटोकॉल में हम vinculin दाग की प्रेरण का वर्णनएड फोकल adhesions और अल्ट्रासाउंड द्वारा Rac1 गतिविधि. फोकल आसंजन के प्रयोग के लिए, आधारभूत स्थिति कि α 5 1-Integrin β के एक ligand पर फैल fibroblasts छवि 3A vinculin युक्त adhesions जब तक एक दूसरे fibronectin रिसेप्टर, syndecan-4, फार्म नहीं के अलावा द्वारा लगी हुई है घुलनशील (3B छवि) ligand के 3,4. हालांकि, अल्ट्रासाउंड के साथ उत्तेजना की सगाई syndecan 4 (छवि -3 सी) के रूप में उसी हद तक फोकल आसंजन गठन लाती है, यह दर्शाता है कि अल्ट्रासाउंड उत्तेजना fibronectin पर निर्भर संकेतन 5 मार्ग के कुछ घटकों के लिए स्थानापन्न कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल के साथ कुंजी बाधा उत्तेजक के अभाव में फोकल आसंजन गठन को नष्ट करने है. प्रोटीन संश्लेषण की cycloheximide द्वारा अधूरा निषेध मैट्रिक्स बयान कि ऑटो प्रोत्साहित करने के लिए कोशिकाओं के लिए पर्याप्त है की अनुमति देगा. कक्षों की भीड़भाड़ भी कम स्तर फोकल आसंजन रचना करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैंपता और सेल सेल और सेल मैट्रिक्स संपर्कों के बीच crosstalk के रूप में अल्ट्रासाउंड के लिए एक गरीब प्रतिक्रिया के लिए एक ही उत्तेजना को अलग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है एक प्रयोग है कि जटिल होगा. बुनियादी परख के विकास के रूप में हम ही प्रयोग है, fibroblasts syndecan 4 (4 छवि) की कमी के साथ दोहराया दिखा. इन fibroblasts अभी भी अल्ट्रासाउंड (छवि 4C) का जवाब है, लेकिन करने के लिए ligand के syndecan-4 (4B छवि) का जवाब असफल. – / – Sdc4 प्रयोग fibroblasts का उपयोग दर्शाता है कि अल्ट्रासाउंड कुछ fibronectin रिसेप्टर्स के लिए वास्तव में जरूरत बायपास कर सकते हैं, और दिखाता है कि कैसे सरल प्रोटोकॉल संकेतन मार्ग के बारे में अतिरिक्त जानकारी हासिल करने के लिए विकसित किया जा सकता है. हम जैव रासायनिक प्रयोग के लिए दिखाना है कि अल्ट्रासाउंड Rac1 के सक्रियण के लिए प्रेरित करना, परख पुल – डाउन कि डेल Pozo एट अल 10. द्वारा वर्णित विधि के एक अनुकूलन है का उपयोग कर सकते हैं. सक्रिय Rac1 0, 10, 30 और पहल के बाद 60 मिनट की तेज़ीअल्ट्रासाउंड उत्तेजना की tiation आधारभूत छवि (5) के लिए लौटने से पहले 10-30 मिनट पर कि Rac1 गतिविधि चोटियों, पता चलता है. Vinculin के लिए कच्चे lysates सोख्ता समय अंक के बीच बराबर लोड हो रहा है सुनिश्चित करता है. परिणाम Rac1 के 3 syndecan-4 की सगाई द्वारा सक्रियण जैसा दिखता है, लेकिन थोड़ा और अधिक fibronectin द्वारा सक्रियण से फैला हुआ है. इसलिए 8-10 दोहराता आम तौर पर महत्वपूर्ण डेटा को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. Rac1 के सक्रियकरण फोकल आसंजन गठन के लिए कोशिकाओं की प्रतिबद्धता के लिए जिम्मेदार है, और नवजात फोकल adhesions के लिए 10-30 मिनट में फार्म शुरू, Rac1 सक्रियण के साथ coinciding. एक बार शुरू की, उन adhesions बड़े आसंजन आंकड़े 3 और 4 में दिखाया सजीले टुकड़े में परिपक्व जारी रहेगा. चित्रा 1 अल्ट्रासाउंड लहर फार्म. अल्ट्रासाउंड एक आंतरायिक 1.5 मेगाहर्ट्ज संकेत शामिल हैं कि कम आयाम (30 मेगावाट / सेमी कारण <> 2 समर्थन, स्थानिक औसत, लौकिक औसत) कोई हीटिंग प्रभाव पड़ता है. आंकड़ा 2. तैयारी और अल्ट्रासाउंड के साथ कोशिकाओं की उत्तेजना के लिए वर्कफ़्लो के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व करते हैं. चित्रा 3 fibroblasts में फोकल आसंजन गठन के अल्ट्रासाउंड प्रेरण. Fibroblasts fibronectin की Integrin बाध्यकारी fibronectin का टुकड़ा syndecan-4-बाध्यकारी (बी) या अल्ट्रासाउंड (सी) के साथ उत्तेजना से पहले (एक टुकड़ा) पर फैल रहे थे. 60 मिनट उत्तेजना के बाद, कोशिकाओं तय vinculin और actin के लिए दाग, और epifluorescence द्वारा imaged. बार = 10 माइक्रोन. चित्रा 4 syndecan-4 की कमी fibroblasts में फोकल आसंजन गठन की अल्ट्रासाउंड शामिल हैं. <emSdc4> / – fibroblasts fibronectin की Integrin बाध्यकारी fibronectin का टुकड़ा syndecan-4-बाध्यकारी (बी) या अल्ट्रासाउंड (सी) के साथ उत्तेजना से पहले (एक टुकड़ा) पर फैल रहे थे. 60 मिनट उत्तेजना के बाद, कोशिकाओं तय vinculin और actin के लिए दाग, और epifluorescence द्वारा imaged. हालांकि Sdc4 / fibroblasts fibronectin असंवेदनशील थे, अल्ट्रासाउंड अभी भी फोकल आसंजन गठन प्रेरित, यह दर्शाता है कि अल्ट्रासाउंड मैट्रिक्स रिसेप्टर सगाई नजरअंदाज. बार = 10 माइक्रोन. चित्रा 5 Rac1 की अल्ट्रासाउंड द्वारा सक्रियकरण. कोशिकाओं समय बिंदु प्रति 6 इस्तेमाल कुओं के साथ 0, 10, 30, और 60 मिनट के लिए प्रेरित किया गया. Rac1 परख पुल – डाउन बार पाठ्यक्रम से जीटीपी Rac1 नमूनों में मौजूद की राशि विरोधी Rac1 एंटीबॉडी के साथ एक पश्चिमी धब्बा (ऊपर छवि) पर ऊष्मायन द्वारा visualized था. बैंड तीव्रता (8-10 का औसत प्रतिकृति) की मात्रा Rac1 वृद्धि हुई है से पता चलता हैctivity अल्ट्रासाउंड संकेत से 10 और 30 मिनट में 60 मिनट (ग्राफ) को आधारभूत स्तर पर लौटने से पहले, जिसके परिणामस्वरूप. त्रुटि पट्टियाँ sem का प्रतिनिधित्व करते हैं

Discussion

इस प्रोटोकॉल में हम विधि है जिसके द्वारा एक इलाज है कि सामान्य रूप से मानव रोगियों को लागू किया जाता है सेल आधारित प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है का वर्णन. अंतिम लक्ष्य के अल्ट्रासाउंड कार्रवाई की आणविक तंत्र को समझने के लिए इतना है कि चिकित्सा परिष्कृत किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में, हम एक मॉडल सेल प्रणाली के रूप में माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) के उपयोग करते हैं, लेकिन अल्ट्रासाउंड भी किया गया है प्राथमिक मानव चमड़ी ⁵ fibroblasts, mesenchymal स्टेम सेल, अस्थिकोरक और ⁶ chondrocytes में प्रभावी होना पाया गया. हम एक उदाहरण जैव रासायनिक परख के रूप में Rac1 सक्रियण का उपयोग करें, लेकिन विधि के समान रूप से प्रोटीन phosphorylation या immunoprecipitation द्वारा प्रोटीन परिसरों के गठन के विनियमन का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Immunofluorescent उदाहरण के लिए हम फोकल आसंजन गठन पर एक प्रभाव अल्ट्रासाउंड का प्रदर्शन, लेकिन किसी भी अणु के पुनर्वितरण की जांच जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक प्लाज्मा झिल्ली साइटोसोलिक कारकों की भर्ती परीक्षा, prote की colocalisationतस्करी vesicles में भारतीय नौसेना पोत या mitotic धुरा संगठन पर अल्ट्रासाउंड के प्रभाव की जांच. अब तक हम खुद लिए fibronectin निर्भर रास्ते का परीक्षण करने के लिए, कोलेजन पर, या वृद्धि कारकों की उपस्थिति में कैसे अल्ट्रासाउंड एक जटिल माहौल में सेल व्यवहार को प्रभावित करता है की एक तस्वीर बनाने के लिए परीक्षण किया जा सकता है अल्ट्रासाउंड की कोशिकाओं पर प्रभाव सीमित है कि अधिक निकट एक में vivo में स्थिति जैसा दिखता है. एक बड़ी चुनौती के लिए अल्ट्रासाउंड का उपयोग कर समय चूक इमेजिंग, जहां emitter की उपस्थिति अल्ट्रासाउंड वर्तमान अतिरिक्त तकनीकी बाधाओं से अवरुद्ध प्रकाश पथ और कंपन के प्रभाव का परीक्षण होगा. हालांकि, तथ्य यह है कि चिकित्सकीय आवेदन उत्तेजना के प्रति दिन केवल 20 मिनट की आवश्यकता का पता चलता है कि उत्तेजना का एक फट के बाद सेल के व्यवहार के विश्लेषण अच्छी तरह से हो सकता है.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester	FisherPerbio	PN22312	25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C
6-well tissue culture plate	Corning	3516	Plastic from other companies can coat poorly
13-mm glass coverslip	Scientific Laboratory Supplies Ltd.SLS	MIC3336	Glass from other companies can coat poorly
PBS	Sigma	D8537
PBS, Ca2+ Mg2+	Sigma	D8662
50K integrin ligand (fibronectin fragment)	Construct description and preparation in 9, 11		Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways
BSA	Sigma	A3059
Cycloheximide	Sigma	C7698	Can be stored as 10mg/ml stock in water
DMEM/25 mM HEPES	Sigma	D6171
Exogen 4000+	Smith & Nephew Inc
Ultrasound coupling gel	Smith & Nephew Inc
SAFHS indicator	Smith & Nephew Inc
hVIN-1	Sigma	V9264
DyLight 488-conjugated anti-mouse	Stratech Scientific	715-485-150
TRITC-labelled phalloidin	Sigma	P1951
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36930
cOmplete protease inhibitor (EDTA free)	Roche	056 489 001	100× stock made up from tablet stored at -20°C
PAK-glutathione agarose beads	Construct description and preparation in 10
Glycerol	Fisher	G/0650/17
Hepes	Apollo Scientific	BI8181	Make 1M stock and pH to 7.4
NaCl	Fisher	S/0160/65
NP40	Sigma	I3021
Sodium Deoxycholate	Sigma	D6750
EGTA	Sigma	E4378
EDTA	Sigma	E5134