In dit protocol beschrijven we de productie, zuivering en titratie van lentivirale vectoren. Wij bieden een voorbeeld van lentivirale vector-gemedieerde gen-levering in de eerste gekweekte neuronen en astrocyten. Onze methoden kunnen ook van toepassing op andere celtypen In vitro En In vivo.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
De productie van lentivirale vectoren voor transduceren Cellen van het centrale zenuwstelsel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Efficiënte gen-levering in het centrale zenuwstelsel (CZS) is belangrijk in het bestuderen van gen-functies, het modelleren van neurologische aandoeningen en het ontwikkelen van therapeutische benaderingen. Lentivirale vectoren aantrekkelijk instellingen transductie van neuronen en andere celtypen in CNS omdat zij beide delen en niet-delende cellen ondersteuning aanhoudende expressie van transgenen transduceren en relatief grote verpakkingen capaciteit en lage toxiciteit 1-3. Lentivirale vectoren zijn met succes gebruikt in transduceren veel neurale celtypen in vitro 4-6 en bij dieren 7-10.
Grote inspanningen zijn gedaan om lentivirale vectoren te ontwikkelen met verbeterde bioveiligheid en efficiëntie voor gen delivery. De huidige derde generatie replicatie deficiënt en zelfstandige inactiverende (SIN) lentivirale vectoren in figuur 1. De vereiste elementen voor vector verpakking worden opgesplitst in vier plasmiden. In de lentivirale transfer plasmide, wordt de U3-regio in lang de 5 'terminale herhaling (LTR) vervangen door een sterke promotor van een ander virus. Deze wijziging kan de transcriptie van de vectorsequentie onafhankelijk van HIV-1 Tat eiwit dat normaal nodig is voor HIV genexpressie 11. De verpakking signaal (Ψ) is essentieel voor encapsidering en Rev reagerend element (RRE) nodig om hoge titer vectoren. De centrale polypurine kanaal (cPPT) is voor de nucleaire invoer van de vector DNA, een functie nodig transduceren niet-delende cellen 12. In het 3 'LTR, de cis-regulerende sequenties volledig uit de U3 regio. Deze verwijdering wordt gekopieerd naar 5 'LTR na reverse transcriptie, waardoor transcriptionele inactivatie van beide LTR. Plasmide pMDLg / pRRE bevat HIV-1 gag / pol-genen, die structurele eiwitten en reverse transcriptase te bieden. pRSV-Rev codeert voor Rev, die bindt aan de RRE voor een efficiënte RNA uitvoer uit de kern. pCMV-G codeertde vesiculaire stomatitis virus glycoproteïne (VSV-G), die HIV-1 Env vervangt. VSV-G vergroot de tropisme van de vectoren en laat de concentratie via ultracentrifugatie 13. Al de genen die coderen voor de accessoire eiwitten, waaronder Vif, Vpr, VPU en Nef zijn uitgesloten in de verpakking systeem. De productie en manipulatie van lentivirale vectoren dienen te worden uitgevoerd volgens de NIH richtlijnen voor onderzoek met recombinant DNA ( http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf ). Een goedkeuring van individuele institutionele biologische en chemische comite voor de veiligheid kan nodig zijn voor het gebruik van lentivirale vectoren. Lentivirale vectoren worden gewoonlijk geproduceerd door cotransfectie van 293T cellen met lentivirale overdracht plasmide en het helper plasmiden die coderen voor de eiwitten vereist vector verpakking. Veel lentivirus overdracht plasmiden en helper plasmiden kunnen worden verkregen uit Addgene een niet-Profit plasmide repository ( http://www.addgene.org/~~V ). Sommige stabiele verpakkende cellijnen zijn ontwikkeld, maar deze systemen minder flexibiliteit en de verpakking efficiëntie algemeen af tijd 14, 15. Commercieel beschikbare transfectie kits kunnen ondersteunen hoge efficiëntie van transfectie 16, maar zij zeer duur zijn voor grootschalige vector preparaten. Calciumfosfaatprecipitatie methoden leveren zeer efficiënte transfectie van 293T-cellen en zorgen zo voor een betrouwbare en kosteneffectieve aanpak voor lentivirale vector productie.
In dit protocol produceren wij lentivirale vectoren door cotransfectie van 293T cellen met plasmiden vier op de calciumfosfaat precipitatie principe, gevolgd door zuivering en concentratie ultracentrifugatie door een 20% sucrose kussen. De vector titers worden bepaald door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) anallyse of door real-time qPCR. De productie en titratie van lentivirale vectoren in dit protocol kan worden afgewerkt met 9 dagen. Wij bieden een voorbeeld van transduceren deze vectoren in muizen neocorticale culturen die zowel neuronen en astrocyten. We tonen aan dat lentivirale vectoren hoge efficiëntie van transductie en celtype-specifieke gen expressie in primaire gekweekte cellen van CNS ondersteunen.
Protocol
1. Verpakking van lentivirale vectoren
Lentivirale vectoren worden geproduceerd door cotransfectie van een lentivirale transfer vector en plasmiden nodig verpakkingsmateriaal 293T cellen door calciumfosfaat transfectiemethode. We maken gebruik van 10 100-mm weefselkweek gerechten in dit protocol. Het kan worden vergroot of verkleind afhankelijk toepassingen. De 293T cellijn wordt gehandhaafd in Dulbecco's gemodificeerd Eagles medium (DMEM) met hoog glucose (4,500 mg / L), aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS), 100 eenheden / ml penicilline, 100 pg / ml streptomycine bij 37 ° C incubator met 5% CO2.
- Zaad 29....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit protocol hebben we laten zien de productie van lentivirale vectoren en de toepassing van deze vectoren in neocorticale culturen. We hebben aangetoond efficiënte en celtype-specifieke transductie met de vectoren die door deze methode. Wanneer de synapsin promoter wordt gebruikt, GFP expressie strikt neuron specifiek. Wanneer de GFAP promoter wordt gebruikt, GFP expressie is uitsluitend in astrocyten. Indien geen celtype-specifieke expressie noodzakelijk is, kan een universele promoter worden gebruikt. We vonden zo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de NIH Neuroscience Blueprint Core-subsidie (P30 NS057105, BJS) naar Washington University, Programma Project Grant NS032636 (BJS) en door het Hope Center for Neurological Disorders.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogusnummer | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Foetaal runderserum | Hyclone | SV3001403 | |
| PBS | Mediatech | 21 tot 040-CM | |
| Trypsine-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| Natriumbutyraat | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Hexadimethrine bromide (Polybreen) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| 293T-cellen | ATCC | CRL-11268 | |
| HT1080 cellen | ATCC | CCL-121 | |
| Falcon 100 x 20 mm weefsel Culture schaal | BD Biosciences | 353003 | |
| 1 x 3 ½ in polyallomoer centrifugebuis | Beckman Coulter- | 326823 | |
| 0.2-micron spuitfilter | Corning | 431219 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 |
Referenties
- Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
