Collectie Protocol for Human Pancreas
Summary
Deze video toont een dissectie procedure voor de verwerking van de menselijke pancreas in meerdere opslagformaten. Anatomische oriëntatie wordt gedurende de gehele pancreas regio's definitie van regionale eilandje samenstelling en dichtheid mogelijk te maken.
Abstract
Deze dissectie en bemonsteringsprocedure is ontwikkeld voor het netwerk voor Pancreatic Organ Donors met diabetes (nPOD) programma om de voorbereiding van de alvleesklier hersteld van postmortale orgaandonoren te standaardiseren. De alvleesklier is verdeeld in 3 grote regio's (hoofd, lichaam, staart), gevolgd door seriële dwarsprofielen in de mediale naar laterale as. Afwisselend secties worden gebruikt voor vaste paraffine en vers bevroren blokken en resterende monsters worden versneden voor snap bevroren monster preparaten, met of zonder RNAse inhibitoren DNA, RNA of eiwit isolatie. Het algemene doel van de alvleesklier dissectie procedure is om de hele alvleesklier te proeven met behoud van anatomische oriëntatie.
Endocriene cellen heterogeniteit op het vlak van eilandje samenstelling, grootte, en getallen wordt gerapporteerd voor de menselijke eilandjes ten opzichte van knaagdieren eilandjes 1. De meerderheid van de menselijke eilandjes uit de alvleesklier hoofd, lichaam en staart regio's bestaat uit insuline-containing β-cellen gevolgd door lagere aantal glucagon bevattende α-cellen en somatostatine bevattende δ-cellen. Alvleesklier polypeptide bevattende PP cellen en ghreline-bevattende epsilon-cellen zijn ook aanwezig, maar in kleine aantallen. In tegenstelling, de uncinate gebied bevat eilandjes die hoofdzakelijk bestaan uit pancreas polypeptide bevatten PP cellen 2. Deze regionale eilandje verschillen komen voort uit verschillen in ontwikkeling. De alvleesklier ontwikkelt zich uit de ventrale en dorsale alvleesklier knoppen in de voordarm en na rotatie van de maag en de twaalfvingerige darm, de ventrale lob beweegt en zekeringen met de dorsale 3. De ventrale lob vormt het achterste deel van de kop met de uncinate proces terwijl de dorsale nok geeft aanleiding tot de rest van het orgel. Regionale pancreas variatie wordt ook gemeld met de staart gebied met hogere dichtheid eilandje in vergelijking met andere regio's en de dorsale lob-afgeleide componenten die een selectief atrofie bij type 1 diabetes <sup> 4,5.
Extra organen en weefsels worden vaak hersteld van de orgaandonoren en zijn lymfklieren, milt en niet-lymfklieren. Deze monsters worden teruggewonnen met soortgelijke formaten de pancreas met de toevoeging van isolatie van cryogeconserveerde cellen. Wanneer de proximale twaalfvingerige darm wordt meegeleverd met de alvleesklier, de twaalfvingerige darm slijmvlies kan worden verzameld voor paraffine en bevroren blokken en gehakt snap bevroren bereidingen.
Protocol
Discussion
Het doel van deze procedure is om een standaard alvleesklier verwerking die kunnen worden geharmoniseerd over meerdere inzamelpunten dus definiëren en vergelijkingen van de resultaten verkregen door verschillende groepen mogelijk te maken. De dissectie methode is gebaseerd op standaard chirurgische pathologie praktijken met extra stappen voor annotatie van de grote pancreas regio's, gevolgd door de intra-regionale onderverdelingen. Standaardisatie van biospecimen verwerkingsmethoden is nodig om collectie van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken de donateurs de familie en de Organ Procurement Organisaties die betrokken zijn bij dit onderzoek en Maria Martino en Irina Kusmartseva voor hun deskundige hulp. Dit werk werd gefinancierd door de Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T., MA) ter ondersteuning van het netwerk voor Pancreatic Organ Donors met diabetes.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Dissection instruments including scalpels with 22 blades | Various | Various | |
| Centrifuge tubes (15 and 50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-5, 430828 | Sterile |
| Cryotubes(1.8 ml) | VWR North America | 89004-300 | Sterile, bar codes optional |
| RNAlater | Ambion | AM7021 | |
| Surgical Pathology Ink | |||
| Cassettes | Mercedes Medical | CAS ECO109 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-245-685 | |
| OCT Freezing Media | TissueTek | 4583 | |
| Molds | ThermoScientific | 58952 | Various sizes |
| Isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | OCT chilling bath |
| Dry ice | OCT chilling bath | ||
| Liquid nitrogen in Dewar flask | Snap freezing cryovials | ||
| Cell culture dish (100mm) | Corning | 430167 | Sterile |
| Hyclone DMEF | ThermoScientific | SH30023.01 | Sterile, store refrigerated, glutamine included |
| Fetal Bovine Serum | Cellgro | 35-010-CV | Sterile, store frozen aliquots |
| Penicillin/Streptomycin/Antifungal | GIBCO | 15240-062 | Sterile, store frozen aliquots |
| Type 9 Paraffin | Richard-Allan Scientific | 8337 | |
| 1X D-PBS | GIBCO | 14190-144 | Sterile |
| 16% Paraformaldehyde | EM Sciences | 15710 | Make fresh, store refrigerated |
| 8% Glutaraldehyde | EM Sciences | 16019 | Make fresh, store refrigerated |
| Biosafety Level 2 hood | Various | ||
| Ultra-low freezer | Various | ||
| Sakura Cassette Printer | Sakura | ||
| Sakura VIP300 | Sakura | Automatic paraffin processor | |
| Paraffin Embedding Station | ThermoFisher |
Table 1. Specific reagents and equipment.
References
- Brissova, M. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).
- Rahier, J. The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).
- Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development. J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).
- Wittingen, J., Frey, C. F. Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas. Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).
- Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. Cellular composition of the human diabetic pancreas. Diabetologia. 24, 366-371 (1983).
- Vaught, J. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).
- Gianani, R. Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies. J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).
- Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hyöty, H. Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of β-cell autoimmunity. Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).
- In’t Veld, P. Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors. Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).
- Töns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans. Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).
