Summary
Este video muestra la disección de un procedimiento para la tramitación de páncreas humano en los formatos de almacenamiento. Orientación anatómica se mantiene a lo largo de las regiones pancreáticas para permitir la definición de la composición islote regional y densidad.
Abstract
Esta disección y el procedimiento de muestreo fue desarrollado para la Red de Donantes de Órganos de páncreas con diabetes (nPOD) programa para estandarizar la preparación de páncreas se recuperó de los donantes de órganos cadavéricos. El páncreas se divide en 3 grandes regiones (cabeza, cuerpo, cola), seguidos de las secciones transversales de serie en toda la medial al eje lateral. Secciones alternas se utilizan para parafina fijo y frescas bloques congelados y muestras remanentes se pican para complemento preparaciones de muestras congeladas, ya sea con o sin inhibidores de RNAsa, para el ADN, ARN, o aislamiento de las proteínas. El objetivo general del procedimiento de disección de páncreas es de probar todo el páncreas, mientras que el mantenimiento de la orientación anatómica.
Endocrino heterogeneidad celular en términos de composición islote, tamaño, y los números se informó de islotes humanos en comparación con 1 islotes de roedores. La mayoría de los islotes humanos de la cabeza del páncreas, regiones del cuerpo y la cola están compuestos de insulina-containing células beta seguido por las menores proporciones de glucagón que contiene alfa-células y que contienen somatostatina-delta-células. Polipéptido pancreático que contienen las células del PP y la grelina que contienen células épsilon, pero también están presentes en pequeñas cantidades. En contraste, la región uncinado contiene islotes que están compuestos principalmente de pancreáticos polipéptido que contienen células PP 2. Estas variaciones de los islotes regionales surgen de las diferencias de desarrollo. El páncreas se desarrolla a partir de las yemas de páncreas ventral y dorsal del intestino anterior y después de la rotación del estómago y el duodeno, se mueve el lóbulo ventral y se fusiona con el dorsal 3. El lóbulo ventral forma la parte posterior de la cabeza incluyendo el proceso uncinado mientras que el lóbulo dorsal da lugar a que el resto del órgano. La variación de páncreas Regional se informó también a la región de la cola que tiene una mayor densidad de islotes en comparación con otras regiones y los componentes derivados del lóbulo dorsal-se someten a una atrofia selectiva de la diabetes tipo 1 Órganos y tejidos adicionales a menudo son recuperados de los donantes de órganos y son los ganglios linfáticos, el bazo páncreas y páncreas no los ganglios linfáticos. Estas muestras se recuperaron con formatos similares como para el páncreas con la adición de aislamiento de células crioconservados. Cuando el duodeno proximal se incluye con el páncreas, la mucosa duodenal puede ser coleccionada para los bloques de parafina y congeladas y preparaciones picadas se congelaron.
Protocol
1. Set-up
- Casetes de etiquetas para los bloques de parafina de forma manual con un lápiz, o automáticamente con una impresora de cartucho. Incluye el identificador de los donantes (CaseID), el tipo de muestra, número de parte alícuota, y cualquier otro documento de identidad única (la hoja de Caso, el Apéndice 1 ).
- Etiqueta OCT moldes como para cassettes con un marcador permanente. Cortar rectángulos de 5-10 cm de papel de aluminio.
- Imprimir etiquetas o de forma manual con marcador permanente todos los viales y tubos. Incluya viales suficientes para muestras instantáneas picada congelada y tubos con medio RPMI para los envíos de frescos. Para los viales se congelaron con RNAlater, añadir 1 ml a cada RNAlater criovial.
- Set-up placas de disección en materia de seguridad campana y los mostradores con los instrumentos de disección estériles (fórceps, escalpelos, hojas, gasas (4x4)), así como cassettes y moldes OCT dispuestos en orden de uso.
- Prepare un baño de congelación, poniendohielo seco en una caja de tamaño mediano de espuma de poliestireno (10x10 cm) a una profundidad de al menos 3 cm y añadir isopentano hasta que el hielo seco está completamente cubierta.
- Opcional: Complete un pequeño recipiente Dewar con nitrógeno líquido.
- Si el páncreas es necesario para la microscopía electrónica (EM), preparar el fijador TAAB mediante la adición de 1,25 ml de paraformaldehído al 16%, 1,25 ml de glutaraldehído al 8%, y 7,5 ml de 0,1 M de PBS. Preparar fijador Lowicryl mediante la adición de 2,5 ml de paraformaldehído al 16% a 7,5 ml de PBS 0,1 M.
- Preparar las soluciones utilizadas para el aislamiento de las células. Para botella de 500 ml de DMEF (con glutamina), seguir las técnicas asépticas al tiempo que añade lo siguiente:
- De suero fetal bovino (SFB): añadir 50 ml, 10% final.
- La penicilina / estreptomicina (Pen / Strep, 10.000 U / ml / 10000 ug / ml stock) - añadir 5 ml Pen / Strep acciones a RPMI para la concentración final de 100 U / ml / 100ug/mL. También añadir 5 ml de una botella de 500 ml de DPBS cuando se utilizan para la celebración de los ganglios linfáticos o muestras de bazo.
2. Personal
3. La disección del páncreas
- Retire el duodeno y el bazo y el páncreas limpiar de grasa extraños, los vasos y los nervios mediante disección roma y cortante
- Coloque el páncreas limpiado en un tablero de disección cubiertas con toallas de papel. Humedezca un bastoncillo de algodón en tinta azul y propagación en la superficie anterior del páncreas. Seque el exceso.
- Opcional: Sumerja un nuevo aplicador de tinta negro y se extendió sobre la superficie posterior del páncreas. Volver páncreas a la orientación normal con superficie anterior frente prosector.
- Cortar el páncreas en 3 regiones: cabeza, cuerpo y cola (Figura 1). Cortar la unión entre head cuerpo y luego dividir la porción restante en ~ porciones iguales para el cuerpo y la cola.
- Pese cada región de pesos páncreas y registro (caso hoja de diagnóstico diferencial ( Anexo 1 )).
- Sección (~ 0.5 cm) de cada región del páncreas en una transversal "barra de pan" forma (Figura 1).
- Utilice las secciones de ambas uniones entre las regiones para las muestras de picada. Dependiendo del tamaño del páncreas, una muestra de la región de unión cuerpo-cola puede ser difícil de obtener en cuyo caso el número de bloques de parafina se puede disminuir para obtener muestras picados o muestras sólo del páncreas cabeza-cuerpo región se puede obtener. Crioviales etiqueta con arreglo a la cabeza o el cuerpo para denotar la región proximal en la unión.
- Picar las piezas y se dividen en partes iguales entre los crioviales (≥ 1 gramo por dosis). La rápida congelación de los viales sin RNALater en nitrógeno líquido o hielo seco en la - suspensión isopentano a continuación, transferir tOA -80 ° C congelador.
- Mantener viales con RNALater a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir el equilibrio, remix y rápidamente congelar en nitrógeno líquido o en la de hielo seco-isopentano suspensión luego se transfieren a un -80 ° C congelador.
- Eliminar las secciones alternas de bloques de parafina y PTU que comienzan con parafina (Figura 1).
- Incline todas las secciones transversales a la derecha.
- Lugar ~ 1,5 x 1,5 x 0,5 cm secciones en las casetes. Si las secciones transversales son demasiado grandes, cortado por la mitad (Figura 2b). Casetes de etiquetas de color azul medio anterior como "A" y la mitad posterior como "B".
- Si las piezas son todavía demasiado grandes, corte cada sección perpendicular al corte anterior (Figura 2c). Casetes de etiquetas DC en sentido horario. Recorte las piezas más, según sea necesario para que quepa en casetes.
- Bloques de números en secuencia dentro de la región, comenzando por la parte más medial.
- Para los bloques de parafina, la posición Cassettes por lo que la etiqueta está a la izquierda y el lugar del tejido en el cassette, manteniendo su orientación. Cerrar la tapa de cassette y la transferencia a un recipiente con 500 ml ~ 10% de formalina neutra tamponada (MNB). Empezar fijación temporización cuando la casete último se coloca en fijador.
- Para los bloques de OCT, vierta una capa delgada de octubre los medios de comunicación en el molde prelabeled a continuación, establecer el tejido en el molde y asegúrese de mantener la orientación y cubrir con el tejido octubre Rápidamente sumergir los moldes OCT en un hielo seco - suspensión de isopentano para ~ 1 minuto. Eliminar de la suspensión y el lugar en hielo seco para el almacenamiento temporal o en el congelador -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
- Obtener ~ 0,5 x 0,5 cm rebanadas de la unión cabeza-cuerpo para microscopía electrónica (EM). Coloque una rebanada en el fijador TAAB y la otra rebanada en el fijador Lowicryl. Guarde los dos tipos de fijador con muestras a 4 ° C durante al menos 48 horas y / o por tiempo indefinido hasta su posterior procesamiento para EM.
4. Bazo, ganglios linfáticos disecciónciones y duodenal mucosa disecciones
- Aislar los ganglios linfáticos pancreáticos (PLN) de la grasa y cortar todo el tejido conjuntivo de la cápsula de los ganglios. Colóquelo en un recipiente estéril de cultivo celular que contiene DMEF. Dependiendo del número total de aislados, se divide en partes alícuotas PLN para los envíos de frescos y criopreservados aislamientos celulares, parafina y / o bloques de OCT, y los viales. Picar los ganglios grandes en trozos no mayores de 0,5 cm.
- Picar no pancreáticas ganglios linfáticos y el bazo en la pequeña (0,5 cm) cubos. Colocar en fijador, los medios de octubre, o DMEM y para envío de muestras frescas o aislamientos criopreservados celular de acuerdo con las cantidades de materiales de partida.
- Abra el duodeno y frote suavemente la mucosa duodenal, limpio de la mucosa con una gasa humedecida. Los cortes de secciones de la mucosa de la parafina y / o bloques congelados de PTU y las muestras de picada para viales, con y sin RNAlater. Congelar como para otras muestras.
5. Envuelva OCT bloques en pre-etiquetados papel de aluminio y coloque bloques de OCT y viales en las cajas para el almacenamiento a largo plazo a -80 ° C.
6. Enviar ejemplos fijos para el procesamiento de parafina
- Fijar los tejidos durante 16 horas (rango de 20 ± 4 horas) con un procesador automático de la parafina o el uso de cronometraje manual. Proceso para los bloques de parafina utilizando un procesador automático ( Anexo 2 ).
- Incluye secciones en la orientación exacta como colocada por el prosector con la etiqueta del cassette a la izquierda. Insertar la mucosa duodenal con la superficie del corte hacia abajo para permitir el examen de la perpendicular de la mucosa hasta la submucosa.
7. Limpie las áreas de disección y desinfectar. Lave los instrumentos de disección y volver a esterilizar. Coloque los tejidos remanentes humanos en fijador de formol para su almacenamiento, como los desechos biomédicos. Eliminar los desechos biomédicos de acuerdo con las normativas locales plazo de un mes.
8. Actualizar el sistema de inventario de la muestra
ve_title "> 9. Resultados representativosEste procedimiento se tramitará un páncreas humano intacto, con un muestreo representativo a través del órgano incluyendo la demarcación de las tres regiones principales, a saber, cabeza, cuerpo y cola de 2 horas. La región uncinado, que se encuentra en la región de la cabeza posterior, se incluye en la disección cabeza. El peso de páncreas media en donantes de órganos que no tienen diabetes fue 82,4 gramos (52,7 - 139,0 gramos). Pesos páncreas regionales fueron aproximadamente iguales (Figura 3).
Este procedimiento también puede permitir la reconstrucción de todo el páncreas mediante diapositivas manchadas de parafina secuencial y bloques de OCT. Múltiples formatos son posibles teniendo en cuenta la máxima utilización de las tecnologías actuales y futuras. La hoja de cálculo actual caso nPOD se proporciona ( Anexo 1 ) que se utiliza para documentar las muestras recuperadas y posteriormente processing por los tipos y cantidades alícuotas.
Figura 1. Esquema general del procedimiento. El páncreas se procesa toda vez que mantiene orientaciones anatómicas. La región de la cabeza es más largo en el eje superior-inferior debido a la presencia del lóbulo pancreático ventral en la región posterior que incluye la región uncinado. La zona sombreada en los cruces indican las regiones utilizados para las muestras de picados en los crioviales. P, de parafina, O, octubre
Figura 2. Esquema de letras para las secciones de páncreas. Cortes transversales del páncreas se pueden dividir en mitades o cuartos y letras en sentido horario.
Figura 3. Pesos de páncreas de donantes de órganos que no tienen diabetes. Lospáncreas intacto de donantes adultos (> 17 años) se pesó luego se divide en regiones y pesos regionales obtenidos. Los datos son medias ± SEM (n = 15).
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Discussion
El objetivo de este procedimiento es definir un proceso estándar de páncreas que puede ser armonizado en los distintos sitios de recolección de varios, para poder comparar los resultados obtenidos con los diferentes grupos. El método se basa en la disección estándar de prácticas de patología quirúrgica con medidas adicionales para la anotación de las regiones más importantes del páncreas seguido de intra-regionales subdivisiones. La estandarización de los métodos de procesamiento de especímenes biológicos se requiere para facilitar la recogida de muestras de alta calidad lo demuestra la publicación de las mejores prácticas para la recolección de muestras biológicas de las organizaciones nacionales de biobancos como el Instituto Nacional del Cáncer 6. El biobancos de muestras páncreas humano de donantes que representan las diversas etapas de la diabetes y las poblaciones de control adecuadas se ha informado 7-9. Sin embargo, los detalles exactos de las muestras recogidas de la región de la cabeza de páncreas han sido insuficientes. Considerable heterogeneidad entre los individuos islote es bien conocido wiº hasta 5 veces las variaciones en la distribución de tamaño de los islotes por lo que la anotación de la región de páncreas que se necesita en el análisis de la heterogeneidad intrínseca 10. Procesamiento de las muestras de páncreas en formatos estandarizados ayudar a resolver los factores individuales de cada paciente de forma que otros factores subyacentes clave de la enfermedad puede ser mejor resuelto.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores agradecen a las familias de los donantes y las organizaciones de obtención de órganos involucrados en esta investigación y Martino María y Kusmartseva Irina por su ayuda de expertos. Este trabajo fue financiado por la Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T., MA) en apoyo de la Red de Donantes de Órganos de páncreas con diabetes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments including scalpels with 22 blades | Various | Various | |
| Centrifuge tubes (15 and 50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-5, 430828 | Sterile |
| Cryotubes(1.8 ml) | VWR North America | 89004-300 | Sterile, bar codes optional |
| RNAlater | Ambion | AM7021 | |
| Surgical Pathology Ink | |||
| Cassettes | Mercedes Medical | CAS ECO109 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-245-685 | |
| OCT Freezing Media | TissueTek | 4583 | |
| Molds | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 58952 | Various sizes |
| Isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | OCT chilling bath |
| Dry ice | OCT chilling bath | ||
| Liquid nitrogen in Dewar flask | Snap freezing cryovials | ||
| Cell culture dish (100mm) | Corning | 430167 | Sterile |
| Hyclone DMEF | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | Sterile, store refrigerated, glutamine included |
| Fetal Bovine Serum | Cellgro | 35-010-CV | Sterile, store frozen aliquots |
| Penicillin/Streptomycin/Antifungal | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | Sterile, store frozen aliquots |
| Type 9 Paraffin | Richard-Allan Scientific | 8337 | |
| 1X D-PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Sterile |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make fresh, store refrigerated |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | Make fresh, store refrigerated |
| Biosafety Level 2 hood | Various | ||
| Ultra-low freezer | Various | ||
| Sakura Cassette Printer | Sakura Finetek | ||
| Sakura VIP300 | Sakura Finetek | Automatic paraffin processor | |
| Paraffin Embedding Station | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
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