Insamling Protokoll för human pankreas
Summary
Denna video visar en dissektion förfarande för bearbetning av mänskliga bukspottkörteln i flera lagringsformat. Anatomisk orientering upprätthålls hela pankreas regioner så att definitionen av regional ö sammansättning och densitet.
Abstract
Denna dissektion och provtagning förfarande utvecklades för nätverket för givare bukspottkörtel orgel med Diabetes (nPOD) för att standardisera beredning av bukspottkörteln återhämtat sig från avlidna organdonatorer. Bukspottkörteln är uppdelad i 3 huvudsakliga områden (huvud, kropp, svans) följt av seriella tvärgående snitt i hela den mediala till lateral axel. Alternerande sektionerna används för fast paraffin och färska frusna blocken och prover kvarleva finfördelas för snabbfrystes provberedningar, antingen med eller utan RNAs hämmare, till DNA, RNA eller protein isolering. Det övergripande målet för bukspottkörteln dissekering förfarandet är att sampla hela bukspottkörteln bibehållen anatomiska orientering.
Endokrina celler heterogenitet i termer av ö sammansättning, storlek och antal redovisas för humana öar jämfört med gnagare öar 1. Majoriteten av humana öar från bukspottkörteln huvudet är kropp och svans regioner som består av insulin-containing p-celler följt av en lägre andel av glukagon innehållande alfa-celler och somatostatin-innehållande ö-celler. Pankreatiska polypeptiden innehållande PP-celler och ghrelin-innehållande celler epsilon är också närvarande men i små antal. I motsats härtill innehåller uncinate regionen cellöar som primärt är sammansatta av pankreatiska polypeptiden innehållande PP-celler 2. Dessa regionala ö variationer uppstå skillnader i utveckling. Bukspottkörteln utvecklas från de ventrala och dorsala pankreas knoppar i framtarmen och efter rotation av magen och tolvfingertarmen, ventralloben drag och säkringar med ryggens 3. Den ventrala loben bildar den bakre delen av huvudet, inklusive uncinate processen medan dorsala loben ger upphov till resten av orgeln. Regional pankreas variation har också rapporterats i samband med svansen regionen har en högre holmen densitet jämfört med andra regioner och den dorsala lob-härledda komponenter som genomgår selektiv atrofi i typ 1-diabetes <sup> 4,5.
Ytterligare organ och vävnader är ofta återhämtat sig från organdonatorer och inkluderar noder pankreas lymfkörtlar, mjälte och icke-pankreas lymfkörtlar. Dessa prover återvunna med liknande format som för bukspottkörteln med tillsats av isolering av kryokonserverade celler. När proximala duodenum medföljer bukspottkörteln, kan duodenal slemhinna tas ut för paraffin och frysta block och malet snabbfrystes preparat.
Protocol
Discussion
Målet med detta förfarande är att definiera en standard bukspottkörteln behandling som kan harmoniseras på flera insamlingsplatser och därmed möjliggöra jämförelser av resultat från olika grupper. Den dissekering Metoden bygger på standard kirurgiska patologi praxis med ytterligare åtgärder för notering av större bukspottkörteln regioner följt av intra-regionala underavdelningar. Standardisering av metoder biospecimen bearbetning behövs för att underlätta insamling av högkvalitativa prov exemplifie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar givarna familjer och orgeln organisationer för tillvaratagande som deltar i denna forskning och Maria Martino och Irina Kusmartseva för deras experthjälp. Detta arbete har finansierats av Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T., MA) till stöd för nätverket för givare bukspottkörtel Organ med diabetes.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Dissection instruments including scalpels with 22 blades | Various | Various | |
| Centrifuge tubes (15 and 50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-5, 430828 | Sterile |
| Cryotubes(1.8 ml) | VWR North America | 89004-300 | Sterile, bar codes optional |
| RNAlater | Ambion | AM7021 | |
| Surgical Pathology Ink | |||
| Cassettes | Mercedes Medical | CAS ECO109 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-245-685 | |
| OCT Freezing Media | TissueTek | 4583 | |
| Molds | ThermoScientific | 58952 | Various sizes |
| Isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | OCT chilling bath |
| Dry ice | OCT chilling bath | ||
| Liquid nitrogen in Dewar flask | Snap freezing cryovials | ||
| Cell culture dish (100mm) | Corning | 430167 | Sterile |
| Hyclone DMEF | ThermoScientific | SH30023.01 | Sterile, store refrigerated, glutamine included |
| Fetal Bovine Serum | Cellgro | 35-010-CV | Sterile, store frozen aliquots |
| Penicillin/Streptomycin/Antifungal | GIBCO | 15240-062 | Sterile, store frozen aliquots |
| Type 9 Paraffin | Richard-Allan Scientific | 8337 | |
| 1X D-PBS | GIBCO | 14190-144 | Sterile |
| 16% Paraformaldehyde | EM Sciences | 15710 | Make fresh, store refrigerated |
| 8% Glutaraldehyde | EM Sciences | 16019 | Make fresh, store refrigerated |
| Biosafety Level 2 hood | Various | ||
| Ultra-low freezer | Various | ||
| Sakura Cassette Printer | Sakura | ||
| Sakura VIP300 | Sakura | Automatic paraffin processor | |
| Paraffin Embedding Station | ThermoFisher |
Table 1. Specific reagents and equipment.
References
- Brissova, M. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).
- Rahier, J. The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).
- Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development. J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).
- Wittingen, J., Frey, C. F. Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas. Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).
- Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. Cellular composition of the human diabetic pancreas. Diabetologia. 24, 366-371 (1983).
- Vaught, J. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).
- Gianani, R. Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies. J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).
- Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hyöty, H. Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of β-cell autoimmunity. Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).
- In’t Veld, P. Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors. Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).
- Töns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans. Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).
