Summary
Denna video visar en dissektion förfarande för bearbetning av mänskliga bukspottkörteln i flera lagringsformat. Anatomisk orientering upprätthålls hela pankreas regioner så att definitionen av regional ö sammansättning och densitet.
Abstract
Denna dissektion och provtagning förfarande utvecklades för nätverket för givare bukspottkörtel orgel med Diabetes (nPOD) för att standardisera beredning av bukspottkörteln återhämtat sig från avlidna organdonatorer. Bukspottkörteln är uppdelad i 3 huvudsakliga områden (huvud, kropp, svans) följt av seriella tvärgående snitt i hela den mediala till lateral axel. Alternerande sektionerna används för fast paraffin och färska frusna blocken och prover kvarleva finfördelas för snabbfrystes provberedningar, antingen med eller utan RNAs hämmare, till DNA, RNA eller protein isolering. Det övergripande målet för bukspottkörteln dissekering förfarandet är att sampla hela bukspottkörteln bibehållen anatomiska orientering.
Endokrina celler heterogenitet i termer av ö sammansättning, storlek och antal redovisas för humana öar jämfört med gnagare öar 1. Majoriteten av humana öar från bukspottkörteln huvudet är kropp och svans regioner som består av insulin-containing p-celler följt av en lägre andel av glukagon innehållande alfa-celler och somatostatin-innehållande ö-celler. Pankreatiska polypeptiden innehållande PP-celler och ghrelin-innehållande celler epsilon är också närvarande men i små antal. I motsats härtill innehåller uncinate regionen cellöar som primärt är sammansatta av pankreatiska polypeptiden innehållande PP-celler 2. Dessa regionala ö variationer uppstå skillnader i utveckling. Bukspottkörteln utvecklas från de ventrala och dorsala pankreas knoppar i framtarmen och efter rotation av magen och tolvfingertarmen, ventralloben drag och säkringar med ryggens 3. Den ventrala loben bildar den bakre delen av huvudet, inklusive uncinate processen medan dorsala loben ger upphov till resten av orgeln. Regional pankreas variation har också rapporterats i samband med svansen regionen har en högre holmen densitet jämfört med andra regioner och den dorsala lob-härledda komponenter som genomgår selektiv atrofi i typ 1-diabetes Ytterligare organ och vävnader är ofta återhämtat sig från organdonatorer och inkluderar noder pankreas lymfkörtlar, mjälte och icke-pankreas lymfkörtlar. Dessa prover återvunna med liknande format som för bukspottkörteln med tillsats av isolering av kryokonserverade celler. När proximala duodenum medföljer bukspottkörteln, kan duodenal slemhinna tas ut för paraffin och frysta block och malet snabbfrystes preparat.
Protocol
1. Set-up
- Etikettkassetter för paraffinblock manuellt med en penna, eller automatiskt med en kassett skrivare. Inkludera givaren identifierare (CaseID), provtyp, alikvot nummer och ytterligare unik identifikation (mål kalkylblad, bilaga 1 ).
- Label ULT formar som för kassetter med en märkpenna. Klipp ut 5-10 cm rektanglar av aluminiumfolie.
- Skriv ut eller manuellt etikett med permanent markering alla flaskor och rör. Inkludera tillräckligt flaskor för malet snabbfrystes prover och rör med RPMI media för färska transporter. För de snabbfrystes rören med RNAlater, tillsätt 1 ml RNAlater till varje köldkärlet.
- Set-up dissekering styrelser i biosäkerhet huva och bänkskivor med steriliserade dissektionsinstrument (pincett, skalpell, blad, gasväv kuddar (4x4)) samt kassetter och ULT formar arrangeras för användning.
- Förbered en frysning bad genom atttorr is i en medelstor frigolitlåda (10x10 cm) till ett djup av minst 3 cm och tillsätt isopentan till dess torrisen är helt täckt.
- Valfritt: Fyll en liten Dewar behållare med flytande kväve.
- Om pankreas behövs för elektronmikroskopi (EM), framställa TAAB fixativ genom tillsats 1,25 ml 16% paraformaldehyd, 1,25 ml 8%-ig glutaraldehyd och 7,5 ml 0,1 M PBS. Framställ Lowicryl fixativ genom tillsats av 2,5 ml 16%-ig paraformaldehyd och 7,5 ml 0,1 M PBS.
- Framställa lösningar som används för isolering av celler. Till 500 ml flaska DMEF (med glutamin), följ aseptiska tekniker under följande tillägg:
- Fetalt bovint serum (FBS): add 50 ml, slutlig 10%.
- Penicillin / streptomycin (pen / strep, 10.000 U / ml / 10,000 xg / ml stamlösning) - tillsätt 5 ml Pen / Strep lager till RPMI till en slutlig koncentration av 100 U / ml / 100ug/mL. Också tillsätt 5 ml till en 500 ml flaska av DPBS när de används för att hålla lymfkörtlar eller prover mjälte.
2. Personal
3. Pankreas Dissektion
- Ta bort tolvfingertarmen och mjälten och rengör bukspottkörteln av främmande fett, fartyg och nerver med trubbig och vass dissektion
- Placera den rengjorda bukspottkörteln på ett skärande ombord täckt med hushållspapper. Doppa en applikator med bomullstopp med blått bläck och sprids på den främre ytan av pankreas. Blot av överskott.
- Valfritt: Doppa en ny applikator i svart bläck och sprids på den bakre ytan i bukspottkörteln. Återgå bukspottkörteln till normal orientering med främre ytan vänd PROSEKTOR.
- Skär bukspottkörteln i 3 regioner: huvud, kropp och svans (figur 1). Klipp övergången mellan head och kropp delar sedan resterande del i ~~~HEAD=NNS lika delar för kropp och svans.
- Väg varje region i bukspottkörteln och spela vikter (mål upparbetning ark ( Bilaga 1 )).
- Sektion (~ 0,5 cm) var och en region av pankreas i en tvärgående "brödlimpa" sätt (figur 1).
- Använd de delar från båda korsningar mellan olika regioner för malet prov. Beroende på bukspottkörteln storlek kan ett prov från kroppen svansen korsningen regionen vara svårt att få i vilket fall antalet paraffinblock kan minskas för att erhålla malet prov eller bara prover från bukspottkörteln huvudet kroppen regionen kan erhållas. Label kryokärl allteftersom huvudet eller kroppen för att beteckna proximalt område vid korsningen.
- Färs bitar och fördela jämnt mellan kryokärl (≥ 1 gram per flaska). Snabbt frysa flaskor utan RNAlater i flytande kväve eller torris - isopentan slurry sedan överföra toa -80 ° C frys.
- Hålla rören med RNAlater vid rumstemperatur under 30 minuter för att möjliggöra ekvilibrering mixa och snabbt frysa i flytande kväve eller i torris-iso-pentan uppslamningen därefter överföra till en -80 ° C frys.
- Ta bort omväxlande sektioner för paraffin och ULT block börjar med paraffin (figur 1).
- Luta alla tvärsektioner till höger.
- Ställe ~ 1,5 x 1,5 x 0,5 cm sektioner i kassetterna. Om de tvärgående sektionerna är för stora, halveras (figur 2b). Etikettkassetter för blått främre hälften så "A" och bakre hälften så "B".
- Om bitarna är fortfarande alltför stor, skär varje sektion vinkelrätt mot föregående skuren (figur 2c). Etikettkassetter AD i en medurs. Beklädningsdetaljer ytterligare efter behov för att passa inuti kassetter.
- Antal block sekventiellt inom regionen, med början med de mest mediala delen.
- För paraffin block, läge cassettes så att etiketten ligger till vänster och placera vävnaden i kassetten, att bibehålla sin orientering. Nära kassetten locket och överföring till en behållare med ~ 500 ml 10% neutral buffrad formalin (NBF). Starta tidtagningen fixering när den sista kassetten placeras i fixativ.
- För ULT block, häll ett tunt lager av oktober material i förmärkta formen låg då vävnaden i formen att vara säker att behålla orientering och täcker vävnad med oktober Snabbt doppa de territorierna formarna i en torr is - isopentan uppslamningen under ~ 1 minut. Bort från uppslamningen och placera på torris för temporär lagring eller i -80 ° C frys under långtidslagring.
- Skaffa ~ 0,5 x 0,5 cm skivor från huvudet kroppen knutpunkt för elektronmikroskopi (EM). Placera en skiva i TAAB fixativ och den andra segment i Lowicryl fixativ. Lagra båda typerna av fixativet med prover vid 4 ° C under åtminstone 48 timmar och / eller på obestämd tid tills vidare bearbetning för EM.
4. Mjälte, lymfkörtel Dissectioner och duodenal slemhinna dissektioner
- Isolera noder pankreas lymfkörtlar (PLN) från fett och trimma alla bindväv till noden kapseln. Placera i sterilt cellodling skål som innehåller DMEF. Beroende på totalt isolerade siffror, dela PLN i portioner för färska transporter, frysförvarade isoleringar cell, paraffin och / eller ULT block, och flaskor. Färs stora noder i bitar som inte är större än 0,5 cm.
- Färs icke-pankreatiska lymfkörtlar och mjälte i små (ca 0,5 cm) kuber. Placera i fixativ, oktober media och eller DMEM för färska prov transporter eller frysförvarade isoleringar cellen enligt mängder av utgångsmaterial.
- Öppna tolvfingertarmen och torka försiktigt av duodenal slemhinna ren från slem med en fuktad kompress. Skära sektioner av slemhinnan för paraffin och / eller frysta OCT block och malda prover för flaskor, med och utan RNAlater. Frys som för andra prover.
5. Wrap ULT block i förväg märkt aluminiumfolie och placera ULT block och flaskor i lådor för långtidslagring vid -80 ° C.
6. Inkomma Fasta Prover för paraffin Processing
- Fix vävnader för 16 timmar (intervall 20 ± 4 timmar) med en automatisk paraffin-processor eller med manuell tidtagning. Processen för att paraffinblock med en automatisk processor ( bilaga 2 ).
- Bädda sektioner i den exakta orienteringen som placeras av PROSEKTOR med kassetten etiketten till vänster. Bädda den duodenala slemhinnan med den skurna ytan nedåt för att medge undersökning av slemhinnan vinkelrätt till submukosa.
7. Rengör dissekering områden och desinficera. Tvätta dissektionsinstrument och åter sterilisera. Placera kvarlevande mänskliga vävnader i formalin fixativ för lagring som biomedicinsk avfall. Kassera biomedicinska avfall enligt lokala föreskrifter inom en månad.
8. Uppdatera systemet Sample Inventory
ve_title "> 9 Representativa resultatDetta förfarande kommer att behandla en intakt human pankreas med representativ provtagning i hela orgeln, inklusive avgränsningen av de tre stora regioner, nämligen huvud, kropp och svans inom 2 timmar. Den uncinate regionen, som finns i den bakre huvudet regionen, ingår i huvudet dissektion. Medianvärdet pankreas vikt organdonatorer utan diabetes var 82,4 gram (52,7 - 139,0 gram). Pankreas regionala vikterna var ungefär lika (Figur 3).
Detta förfarande kan också möjliggöra rekonstruktion av hela bukspottkörteln med färgade bilder från sekventiell paraffin och ULT block. Flera format är möjliga vilket ger maximal användning för nuvarande och framtida teknik. Den nuvarande nPOD fallet arbetsblad ges ( bilaga 1 ) som används för att dokumentera återvunna prov och efterföljande procEssing av delmängder typer och kvantiteter.
Figur 1. Övergripande syftet med förfarandet. Hela bukspottkörteln behandlas samtidigt anatomiska riktlinjer. Huvudregionen är längre i den överlägsna underlägsen axeln på grund av närvaron av den ventrala pankreatisk loben i den bakre regionen som innefattar den uncinate regionen. Streckade området i korsningar betecknar regioner som används för malet prov i kryokärl. P Paraffin, O, oktober
Figur 2. Bokstäver system för pankreas sektioner. Tvärgående bukspottkörteln skivor kan ytterligare delas in i halvor eller fjärdedelar och märkt i medurs sätt.
Figur 3. Pankreas vikter från organdonatorer utan diabetes.intakt bukspottkörteln från vuxna donatorer (> 17 år) vägdes sedan upp i regioner och erhållits regionala vikter. Data visas som medelvärden ± SEM (N = 15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med detta förfarande är att definiera en standard bukspottkörteln behandling som kan harmoniseras på flera insamlingsplatser och därmed möjliggöra jämförelser av resultat från olika grupper. Den dissekering Metoden bygger på standard kirurgiska patologi praxis med ytterligare åtgärder för notering av större bukspottkörteln regioner följt av intra-regionala underavdelningar. Standardisering av metoder biospecimen bearbetning behövs för att underlätta insamling av högkvalitativa prov exemplifieras av publiceringen av bästa praxis för biospecimen samling från nationella biobanker organisationer som National Cancer Institute 6. Den biobankning mänskliga bukspottkörteln prover från donatorer som representerar olika stadier av diabetes och lämpliga populationer kontroll har rapporterats 7-9. Har dock exakta detaljer för de prov som tagits från bukspottkörteln huvudet regionen saknats. Betydande interindividuella holmen heterogenitet är väl känd wite upp till 5-faldiga skillnader i holmen storleksfördelning så att anteckning i bukspottskörteln region behövs vid analys av inneboende heterogenitet 10. Behandling bukspottkörteln prover i standardiserade format kommer att bistå med att lösa individuella patientfaktorer så att andra underliggande viktiga sjukdomsfaktorer bättre kan lösas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna tackar givarna familjer och orgeln organisationer för tillvaratagande som deltar i denna forskning och Maria Martino och Irina Kusmartseva för deras experthjälp. Detta arbete har finansierats av Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T., MA) till stöd för nätverket för givare bukspottkörtel Organ med diabetes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments including scalpels with 22 blades | Various | Various | |
| Centrifuge tubes (15 and 50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-5, 430828 | Sterile |
| Cryotubes(1.8 ml) | VWR North America | 89004-300 | Sterile, bar codes optional |
| RNAlater | Ambion | AM7021 | |
| Surgical Pathology Ink | |||
| Cassettes | Mercedes Medical | CAS ECO109 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-245-685 | |
| OCT Freezing Media | TissueTek | 4583 | |
| Molds | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 58952 | Various sizes |
| Isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | OCT chilling bath |
| Dry ice | OCT chilling bath | ||
| Liquid nitrogen in Dewar flask | Snap freezing cryovials | ||
| Cell culture dish (100mm) | Corning | 430167 | Sterile |
| Hyclone DMEF | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | Sterile, store refrigerated, glutamine included |
| Fetal Bovine Serum | Cellgro | 35-010-CV | Sterile, store frozen aliquots |
| Penicillin/Streptomycin/Antifungal | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | Sterile, store frozen aliquots |
| Type 9 Paraffin | Richard-Allan Scientific | 8337 | |
| 1X D-PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Sterile |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make fresh, store refrigerated |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | Make fresh, store refrigerated |
| Biosafety Level 2 hood | Various | ||
| Ultra-low freezer | Various | ||
| Sakura Cassette Printer | Sakura Finetek | ||
| Sakura VIP300 | Sakura Finetek | Automatic paraffin processor | |
| Paraffin Embedding Station | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Brissova, M. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).
- Rahier, J. The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).
- Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development. J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).
- Wittingen, J., Frey, C. F. Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas. Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).
- Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. Cellular composition of the human diabetic pancreas. Diabetologia. 24, 366-371 (1983).
- Vaught, J. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).
- Gianani, R. Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies. J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).
- Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hyöty, H. Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of β-cell autoimmunity. Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).
- In't Veld, P. Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors. Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).
- Töns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans. Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).
