Il nostro protocollo è stato sviluppato per fornire in modo pulito e facilmente le cellule o isolotti sotto la capsula renale di topi. Le cellule sono concentrate in pellet nel tubo finale utilizzato per il trapianto delle cellule sotto la capsula renale. La facilità di questa tecnica riduce lo stress per le cellule e il mouse.
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Articolo metodologico
Il trapianto di isole pancreatiche nella capsula renale di topi diabetici
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il nostro protocollo è stato sviluppato per fornire in modo pulito e facilmente le cellule o isolotti sotto la capsula renale di topi diabetici o normale. Abbiamo scoperto che era più facile concentrare le isolette o cellule in pellet nel tubo di consegna finale (PE50) utilizzato per il trapianto di cellule sotto la capsula renale. Questa tecnica fornisce velocità e facilità, riducendo qualsiasi sforzo eccessivo per le celle o per il mouse.
Caricamento in corso: Fondata, raccolte a mano, isolotti o cellule pellet sono accuratamente aspirato dal fondo di una provetta 1,5 ml con un pipetteman P200 e un rettilineo, a parete sottile punta della pipetta. Una lunghezza di PE50 tubo è attaccato alla punta della pipetta con un piccolo tubo di silicone adattatore. Le cellule sono permesso di stabilirsi, in punta, e poi vengono trasferiti al tubo PE50 lentamente componendo il pipetteman. Una volta che le cellule sono quasi alla fine del tubo PE50, un punto di discontinuità è fatto e il tubo in silicone adattatore è posizionato sopra il nodo. La PE50 tubo è trasferito ad un 15 ml conica contenente una riduzione del 5 pipetta ml, e il tubo PE50 è registrato sul lato della pipetta 5 mL per evitare il curling durante la centrifugazione. Le cellule sono permesso di raggiungere 1.000 giri al minuto e si fermò.
Trapianto: topi destinatari sono anestetizzati, rasato e pulito. Una piccola incisione viene fatta sul fianco sinistro del mouse e il rene è esposto. L', rene grasso e il tessuto sono mantenute umide con normale soluzione salina tampone. L'estremità distale del PE50 è attaccato ad una siringa Hamilton azionamento della vite, contenente un puntale, utilizzando il tubo adattatore silicone. Un piccolo nick è fatto sul lato fianco destro del rene, non troppo grande né troppo profondo. L'estremità smussata del tubo PE50, più vicino alle celle, è accuratamente posizionato sotto la capsula, il tubo viene spostato delicatamente per fare spazio, mentre tampone soluzione fisiologica; una capsula secca può strappare facilmente. Una piccola bolla d'aria è fornito sotto la capsula lentamente componendo il disco vite siringa. Isolotti sono poi lentamente consegnati dietro la bolla d'aria. Omeostasi renale una volta le isole sono state consegnate viene mantenuta e la knick è cauterizzato a basse temperature. Il rene è posto nuovamente dentro la cavità ed il peritoneo e la pelle sono suturate e pinzati. I topi sono immediatamente trattati con Buprenorfina e Flunixin mq e posto in una gabbia su una piastra elettrica.
Protocollo
Preparazione di isole per trapianto (Tx)
- Sotto un microscopio invertito, selezionare manualmente isolette con una Pipetman P200 e punta della pipetta direttamente dalla isole coltivate in un piatto di 100mm.
- Conte isolotti 100 in una volta e trasferire in ogni provetta (~ 500 isolotti / tubo / mouse).
- Lasciare isolotti di depositarsi sul fondo dei tubi microcentrifuga.
- Disegna uno isolotto a pellet in un Pipetman P200 (fissata a 130ul) utilizzando una scala a parete sottile punta della pipetta.
- Posizionare un adattatore tubo di silicone sopra la punta della siringa. Inserire una lunghezza di PE50 tubo nel adattatore ....
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Discussione
Questo protocollo fornisce una soluzione pratica ed efficiente per fornire in modo pulito e facilmente le cellule o isolotti sotto la capsula renale di topi diabetici o normale. La tecnica di concentrazione e cubettatura le isolette o cellule nel tubo di consegna finale (PE50) utilizzato per il trapianto di cellule sotto la capsula renale offre un metodo semplice ed efficace di trapianto di cellule, riducendo qualsiasi sforzo eccessivo per le celle o per il mouse.
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Ringraziamenti
UCSF Diabetes Center. NIH UCSF DERC Islet Core. JDRF. LifeScan Inc. Johnson Johnson & Company.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Guanti chirurgici | Fisher Scientific | 11-394-95(sz) | |
| Spugne per antisepsi chirurgica | Moore Medical | 42940AK | |
| Pinze | Miltex Inc. | 6-114 e 6-26 | 2 con denti, 2 dritte |
| Forbici da dissezione n=2 | Miltex Inc. | 5-290 | |
| Rasoio Oster (lama taglia 40) | Fisher Scientific | 01-305-10B | |
| Compresse sterili di garza 4x4 | Moore Medical | 08252AK | |
| Compresse di iodopovidone | Moore Medical | 08486AK | |
| Compresse alcoliche | Fisher Scientific | 14-819-2 | |
| Pad riscaldante | Moore Medical | 42508AK | |
| Aghi 23G o 25G | lunghi 1" | ||
| Soluzione Cidex | Moore Medical | 07535AK | per la pulizia e la disinfezione degli strumenti |
| Tubing in polietilene PE50 | BD Biosciences | 427411 | PE50, 0,965 mm di diametro esterno x 0,58 mm di diametro interno |
| Cidex + soluzione a 28 giorni | Moore Medical | 35625AK | |
| Tubing in silicone | Spectrum Chromat. | 123732 | 5/32” diametro esterno x 1/32” diametro interno |
| Contenitore per sterilizzazione strumenti | Moore Medical | 39074AK | |
| Punte per pipetta dritte | USA Scientific, Inc. | 1111-0810 | sterili |
| Siringa di vetro con vite di comando | Hamilton Co | 1001 | |
| Strumento cauterizzante | Roboz Surgical Instruments Co. | RS230 | |
| Pinza per aghi | Moore Medical | 41-067 | |
| Seta 5-0 | LOOK Surgical | 754B | per sutura (6-C) |
| Tampone di ovatta | Moore Medical | ||
| Stapler autoclip da 9 mm | BD Biosciences | 7630 | |
| Staples da 9 mm | BD Biosciences | 7631 | |
| Stacca-staples da 9 mm | BD Biosciences | 7637 |
Riferimenti
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A.
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Ristampe e permessi
