揭示复杂脑部拓扑结构的全脑免疫组织化学染色法

摘要

神经回路在功能区室中具有拓扑性组织，并具有特定的分子特征。本文提供了利用一种通用的全脑免疫组织化学染色方法揭示全脑拓扑结构的实用与技术步骤。我们以小脑经典的细胞构筑和神经环路为例，展示了该方法的应用价值。

摘要

小脑具有重复且结构清晰的细胞架构，是研究脑拓扑结构的理想模型系统。在其相对均一的细胞结构之下，存在着一系列复杂的矢状旁域，表现出基因与蛋白质表达的多样性。小脑的分子分区特征在传入纤维的解剖与功能组织中得到对应体现。为了全面理解小脑组织的复杂性，我们此前优化了一种适用于高通量分析小鼠小脑发育模式缺陷的全脑染色方法。本实验方案详细描述了在成年小鼠小脑中成功实现全脑免疫染色以揭示蛋白质表达模式所需的试剂、工具及具体操作步骤。文中重点展示的步骤以zebrinII/aldolaseC的表达为例，说明该方法如何在保持脑组织天然三维构象的前提下揭示精细的脑拓扑结构。此外，还介绍了对原方案的若干改进，使其可用于观察传入投射中的蛋白质表达以及适用于较大体积的小脑样本，从而支持分子拓扑结构的比较研究。为说明这些应用，文中包含了对大鼠小脑传入纤维染色的实验数据。

方案

1. 动物灌注与小脑解剖

1. 根据蛋白质的不同，灌注对于成功染色可能至关重要^1,2经心脏灌注是一种侵入性、非存活性操作，需要正确使用麻醉剂。在进行该操作前，必须接受适当培训，并获得机构批准和实验动物管理与使用委员会（IACUC）的批准。建议始终咨询机构的兽医，以协助明确实验要求并获取正确的培训。操作前应确保动物已处于深度麻醉状态，对足部或尾部夹捏等刺激无反应。使用剪刀切开腹部皮肤和肌层，随后沿两侧胸骨旁剪开以暴露肋骨腔。此外，实验人员可通过剪开膈肌周围的筋膜来扩大内部操作空间。将腹壁和胸壁向上提起，即可暴露心脏。在右心房做一小切口以使血液流出，随后立即将灌注针插入左心室。推荐使用基本的重力静水压泵来输送灌注液（参见 表1 详情见）。首先用 0.1 M 磷酸盐缓冲盐水（PBS，见 表3）直至液体变澄清。然后关闭水压泵，迅速将溶液输送管切换至含有4%多聚甲醛（PFA，见 表3）用 PBS 稀释后，重新启动泵以输送固定液。使用泵并非必需：经过练习后，可使用两支分别装有 PBS 和 4% PFA 的注射器缓慢注入溶液。
2. 仔细将脑组织从颅骨中解剖出来而不对组织造成任何损伤至关重要。即使在解剖过程中对脑组织造成微小的撕裂，也会逐渐扩展为明显的裂隙，这些裂隙会滞留抗体，从而在组织处理过程中导致人为假象的染色（例如，图中红色星号所示）。 图 2）。对于....

讨论

我们已阐述了利用一种通用的免疫组织化学方法对发育中和成年脑组织进行整体染色以成功显示蛋白质表达所需的技术细节。通过该方法，无需繁琐且耗时的组织切片步骤，即可分析复杂的分子表达模式并理解脑部拓扑结构。

该方案已被用于揭示成年^1,2,8,9和出生后早期小鼠小脑^10,11,12中多种浦肯野细胞蛋白的条带状表达模式。我们最初的研究还证明了整体染色法在检测颗粒细胞抗原表达¹以及顺行示踪位于颗粒层、距软脑膜表面约250 μm深处的苔藓纤维²方面的实用性。此外，已有若干研究对原始方案进行了改进，以成功实现浦肯野细胞^1,13（抗原修复）和传入纤维^7,14（信号放大；图2）中蛋白的染色。整体免疫组织化学染色技术还已被应用于多种哺乳动物^4,15和鸟类^16,17的小脑，用于绘制神经退行性疾病小鼠模型中浦肯野细胞丢失的图谱^18,19，并被修改后用于心脏²⁰.......