En parasitt-redning og transformasjon analysen med THP1 celler infisert<em> In vitro</em> Med<em> Leishmania donovani</em> Har blitt optimalisert for anti-leishmanial narkotika screening. Analysen omfatter differensiering av THP1 celler, infeksjon med promastigotes, behandling med test narkotika, kontrollert lyse av de infiserte makrofager, redning av amastigotes, transformasjon til promastigotes og overvåking promastigote vekst og spredning med en fluorometrisk analyse.
Leishmaniasis er en av verdens mest forsømte sykdommer, hovedsakelig påvirker de fattigste av de fattige, hovedsakelig i utviklingsland. Over 350 millioner mennesker regnes i fare for å pådra leishmaniasis, og ca 2 millioner nye tilfeller forekommer årlig en. Leishmania donovani er den utløsende agent for visceral leishmaniasis (VL), den mest dødelige formen av sykdommen. Valget av stoffer tilgjengelig for å behandle leishmaniasis er begrenset 2; nåværende behandlinger gir begrenset effekt og mange er giftige ved terapeutiske doser. I tillegg har de fleste av de første linje behandling narkotika allerede mistet deres nytte på grunn av økende multippel legemiddelresistens 3. Den nåværende portefølje av anti-leishmanial legemidler er også sterkt redusert. Vedvarende innsats for å berike en ny anti-leishmanial medisiner rørledning, og dette arbeidet er avhengig av tilgjengeligheten av egnede in vitro screening modeller.
<p class = "jove_content"> In vitro promastigotes 4 og axenic amastigotes analyser 5 er primært brukes til anti-leishmanial narkotika screening imidlertid ikke kan være hensiktsmessig på grunn av betydelige mobilnettet, fysiologiske, biokjemiske og molekylære forskjeller i forhold til intracellulære amastigotes. Analyser med makrofag-amastigotes modeller anses nærmest de patofysiologiske betingelser for leishmaniasis, og er derfor den mest hensiktsmessige for in vitro screening. Differensierte, ikke-delende humane akutte monocyttisk leukemi celler (THP1) (gjøre en attraktiv) alternativ til isolerte primære makrofager og kan brukes for analysering anti-leishmanial aktivitet av forskjellige forbindelser mot intracellulære amastigotes.Her presenterer vi en parasitt-redning og transformasjon analysen med differensierte THP1 celler infisert in vitro med Leishmania donovani for screening rene forbindelser og naturlig proddukter ekstrakter og bestemme effekten mot intracellulære Leishmania amastigotes. Analysen omfatter følgende trinn: (1) differensiering av THP1 celler til ikke-delende makrofager, (2) infeksjon av makrofager med L. donovani metacyclic promastigotes, (3) behandling av infiserte celler med test narkotika, (4) kontrollert lysis av infiserte makrofager, (5) release / redning av amastigotes og (6) transformasjon av levende amastigotes til promastigotes. Analysen ble optimalisert med vaskemiddel behandling for kontrollert lysis av Leishmania-infiserte THP1 celler for å oppnå tilnærmet komplett redning av levedyktige intracellulære amastigotes med minimal effekt på deres evne til å transformere til promastigotes. Forskjellig macrophage: promastigotes forholdstall ble testet for å oppnå maksimal infeksjon. Kvantifisering av infeksjon ble utført gjennom transformasjon av levende, amastigotes reddet Leishmania til promastigotes og evaluering av deres vekst av en alamarBlue fluorometrisk analyse i 96-brønners mikroplater. Denne analysen kan sammenlignes med det for tiden brukes mikroskopiske, transgen reporter gen og digital-bildeanalyse analyser. Denne analysen er robust og måler bare live intracellulære amastigotes sammenlignet med reporter gen og bildeanalyse analyser, som kanskje ikke skille mellom levende og døde amastigotes. I tillegg har analysen blitt validert med en gjeldende panel av anti-leishmanial narkotika og har blitt brukt i stor skala screening av rene forbindelser og et bibliotek av naturlige produkter fraksjoner (Tekwani et al. Upublisert).
Det er flere metoder tilgjengelig for anti-leishmanial narkotika screening basert på makrofag-amastigote modeller. Analyser kan gjøres med makrofager samlet fra vertsdyr nemlig peritoneal eksudat celler (PEC), perifert blod monocytter celler (PBMC) 6 eller benmarg-avledet makrofager (BMM) eller i monocyttisk cellelinjer som mus (J774 og RAW264.7 ) 7 og human (THP1, U937, HL-60) 8 monocyttisk celler. Analysene, som bruker å dele vertsceller, må sørge for at de konfunderende effekter av narkotika aktivitet på både parasitt og vert celler nummer er vurdert. Differensiert primære makrofager innsamlet fra forskjellige kilder slik som mus og rotter er ikke-delende i naturen, men disse cellepreparater har kanskje ikke homogene cellepopulasjoner. Monocyttisk celler-avledet cellelinjer er homogene i naturen og er en bedre modell for makrofag-amastigote-basert screening. Ut av ulike monocyttisk cellelinjer, differentiated THP1 celler (humant akutt monocyttisk leukemi cellelinje) kan danne en ikke-delende monolayer og tilby et attraktivt alternativ til primære isolerte makrofager.
Macrophage-amastigote-basert screening kan gjøres på flere måter. Klassisk mikroskopisk vurdering basert på direkte celle og parasitt telle 9 er arbeidskrevende. Fraværet av automatisering begrenser nytten av denne analysen. Telling av celler er tidkrevende og kan gi unøyaktig bestemmelse av IC 50 verdier siden bestemmelse av parasitten levedyktighet gjennom en farging prosedyre er vanskelig. Mange fluorescerende fargestoffer og monoklonale antistoffer kan benyttes for flowcytometrisk analyser 10, 11, men disse analysene er også begrenset på grunn av mindre følsomhet og begrensning av tidsintervallet av medikament-behandling til bare en dag. Det er flere rapportørgen analyser tilgjengelig for kvantifisering veksten av intracellulære amastigotes 12,13,14. En automated screening kan være mulig ved hjelp av rapportørgrupper gener, men disse analysene har også visse ulemper. Først fleste av disse analysene krever narkotika valg for å opprettholde episomal uttrykk for reporter gener, som kanskje ikke er ideelt for en narkotika screening eksperiment. Måten hvorved rapportørgen introduseres kunne også påvirke de fysiologiske egenskapene til parasitten og har en innvirkning på screening. Hvis reporteren genet er den delen av en episomal plasmid, kan den relative effekt av reporter avhenge kopitall av den transfekterte plasmid (som varierer fra celle til celle) i stedet for på aktiviteten til stoffet 14. Noen reporter parasitter som er transformert parasitter trenger ikke selektiv trykk til å holde rapportørgen; imidlertid kan det være biologiske konsekvenser enten ved å forstyrre genomisk arkitektur eller bare ved tilstedeværelsen av de utenlandske reporter proteiner 15. I noen rapportørgen baserte analyser, er detspørsmål om følsomhet og bakgrunn aktivitet 16. Viktigst, kan mange av de reporter genuttrykk analyser, spesielt en med GFP reporter gene15, ikke skille mellom de levende og døde intracellulære amastigotes. Assays basert på luciferase reporter gen kan skjelne mellom levende og døde intracellulære amastigotes, men underlaget og cellelyse buffer for disse analysene er dyrt for storskala screening 17. For å overvinne disse demerits og begrensninger av tidligere makrofag-amastigote-baserte screening-analyser, har vi utviklet og optimalisert denne parasitten-redning og transformasjon analysen. Denne analysen er basert på THP1 celler, som har god homogenitet og er ikke-delende i naturen, som vertsceller.
Parasitten-Rescue-Transformation-Assay analysen beskrevet her kan sammenlignes med analysen er basert på Digital-Image-Analyse-Direct-Opptelling av den intracellulære amastigotes. Fluoriserende og DIC mikroskopi, digital image analyser av ImageJ for differensial telling av macrophage kjerner og parasitten kjerner har videreutviklet den mikroskopiske telling analysen. Fange bilder under fluorescerende lys filtre og differensial interferens kontrast (DIC) filtre har forbedret kvaliteten av det digitale bildet for mer nøyaktig telling av de intracellulære parasitter. Både lysstoffrør og DIC bilder kan bli slått sammen for å oppnå de digitale bildene med klare macrophage celle skisserer og fluorescerende intracellulær kjerner. Macrophage kjerner og parasitten kjerner kan forskjellig anerkjent med ImageJ. Derfor både Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay og Parasite-Rescue-Transformation-analysen har potensial for automatisering og søknad til storskala screening. De kritiske trinnene i parasitt-Rescue-Transformasjon-Assay er: (a) gjentatte vask av THP1 cellekulturer etter eksponering for Leishmania promastigotes, for å sikre nesten fullstendig fjerning av den ikke-internalized promastigotes og (b) kontrollert lyse av de infiserte THP1 celler med SDS. Begge trinnene kan også styres med automatisering og bør ikke gå på akkord med gjennomstrømming av analysen. Det andre trinnet av vaskinger, etter eksponering av Leishmania infiserte THP1 celler til test legemidler / forbindelser fjerner de gjenværende ikke-internaliserte parasitter, hvis noen. Parasitten-Rescue-Transformation-analysen gir betydelige fordeler fremfor eksisterende mikroskopisk, reporter gen og bildeanalyse analyser. Analysen er enkel, robust, og reproduserbar, kan automatiseres for storskala screening og derfor bør ha viktig anvendelse i screening av store forbindelser biblioteker for nye anti-leishmanial medisiner. Videre kan analysen også anvendes for å evaluere smittsomhet av klinisk, så vel som, laboratorie isolater av Leishmania in vitro.
The authors have nothing to disclose.
Den NCNPR-USDA-ARS Scientific avtale No 58-6408-2-0009, CDMRP stipend Award # W81XWH-09-2-0093 av US Army Medical Research og forsyningskommando Command.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich USA | P1585 | Required for differentiation of THP1 cells. |
RPMI-1640 Medium | Invitrogen | 23400021 | |
Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber) | Thermo Scientific Nunc | 178599 | |
Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates | BD Falcon | 353075 | Plates to perform 96-well plate assay |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich USA | A4888 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
Pentamidine Isothionate Salt | Sigma-Aldrich USA | P 0547 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
Miltefosine | EMD Biosciences USA | 475841 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml) |
Sodium Stibogluconate | EMD Biosciences USA | 567565 | Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml) |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich USA | L 5750 | |
Fluorescence Microscope | NIKON | ECLIPSE 90i | |
Fluorescence Microplate Reader | BMG | Polar Star Galaxy | |
Mounting Medium | Sigma-Aldrich USA | M 1289 | |
alamarBlue | AbD Serotec | BUF012 B | |
SYBR Green I | Sigma-Aldrich USA | S 9430 | |
Sodium Bicarbonate | Fisher Sci. | 523500 | |
Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich USA | P2256 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich USA | M6250 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich USA | P9416 | |
Tween 80 | Sigma-Aldrich USA | P6474 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich USA | T8787 | |
NP-40 | Calbiochem | 492016 |