Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Usando sintéticos matrizes genéticas

Alla Gagarinova; Mohan Babu; Jack Greenblatt; Andrew Emili

doi:10.3791/4056

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Artigo de método

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias

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DOI:

10.3791/4056

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12 de novembro de 2012

Alla Gagarinova^*¹ , Mohan Babu^*²^,³ , Jack Greenblatt¹^,² , Andrew Emili¹^,²

¹Department of Molecular Genetics, University of Toronto, ²Banting and Best Department of Medical Research, Donnelly Centre, University of Toronto, ³Department of Biochemistry, Research and Innovation Centre, University of Regina

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Sistemáticas e em grande escala genético sintético telas (gene-gene ou epistasia) interação pode ser usado para explorar a redundância genética e via de cross-talk. Aqui, descrevemos um alto rendimento quantitativo tecnologia de rastreamento genético sintético matriz, denominada eSGA que desenvolvemos para a elucidação de relações epistáticos e explorar redes de interação genéticos em Escherichia coli.

Resumo

Fenótipos são determinados por uma série complexa de física (por exemplo, proteína-proteína) e funcionais (por exemplo, gene-gene ou genética) interacções (GI) ^1. Enquanto interações físicas podem indicar que as proteínas bacterianas estão associadas como complexos, eles não revelam necessariamente via de nível relationships1 funcionais. Telas de GI, em que o crescimento de mutantes duplos tendo dois genes eliminados ou inactivados é medida e comparada com os mutantes correspondentes individuais, pode iluminar dependências epistáticos entre loci e, portanto, proporcionam um meio para consultar e descobrir novas relações funcionais ^2. Mapas de grande escala GI foram relatados por organismos eucarióticos como o fermento ^3-7, mas a informação GI permanece escassa para procariontes ^8, o que dificulta a anotação funcional de genomas bacterianos. Para este fim, e outros desenvolveram alto rendimento quantitativo bacterianas métodos de rastreio de IG ^{9, 10} Aqui, apresentamos os principais passos necessários para realizar E. quantitativa coli Genetic Matriz Sintética procedimento de triagem (eSGA) em um genoma de ^escala-9, utilizando-se a conjugação bacteriana natural e recombinação homóloga para gerar sistematicamente e medir a aptidão de um grande número de mutantes duplos em um formato de matriz de colónia. Resumidamente, um robô é usado para transferir , através de conjugação, cloranfenicol (Cm) - marcado alelos mutantes de Hfr engenharia (alta freqüência de recombinação) 'linhagens doadoras em um conjunto ordenado de canamicina (Kan) - marcadas F-receptor cepas. Normalmente, usamos a perda de função de mutantes simples tendo deleções de genes não essenciais (por exemplo, a recolha de 'Keio' ¹¹⁾ e as mutações de genes essenciais hypomorphic (isto é, os alelos que conferem a expressão da proteína reduzida, a estabilidade, ou a actividade de ^{9, 12, 13)} para consultar as associações funcionais de genes essenciais e não essenciais, resvamente. Após a conjugação e subsequente troca genética mediada por recombinação homóloga, os duplos mutantes resultantes são seleccionadas em meio sólido contendo ambos os antibióticos. Depois de conseqüência, as placas são digitalmente fotografada e tamanhos colônia são quantitativamente registados com um sistema interno de tratamento automatizado de imagem ^14. IG são reveladas quando a taxa de crescimento de um mutante duplo ou é significativamente melhor ou pior do que ⁹ esperada. SIG (ou negativo) agravante muitas vezes resultam entre a perda de função de mutações em pares de genes de vias compensatórias que incidem sobre o mesmo processo essencial ^2. Aqui, a perda de um único gene é tamponada, tal que um ou outro mutante único é viável. No entanto, a perda de ambas as vias é prejudicial e resulta em letalidade sintética ou de doença (isto é, crescimento lento). Inversamente, aliviando (ou positivos) podem ocorrer interacções entre os genes na mesma via ou a proteína do complexo ^2, como odeleção de um ou outro gene sozinho é frequentemente suficiente para perturbar o funcionamento normal da via ou complexo de tal forma que as perturbações adicionais não reduzem a actividade, e, consequentemente, o crescimento adicional. No geral, a identificação sistemática e análise de redes de GI pode fornecer imparciais, mapas globais de relações funcionais entre um grande número de genes, dos quais via de informações em nível de perdida por outras abordagens podem ser inferidas ^9.

Protocolo

1. Construção de cepas mutantes HFR Doadores Cavalli por Recombineering ^{15, 16}

Os passos para a construção dos corantes doadores eSGA são descritos abaixo. Resumidamente, usamos λ alvo - Red recombinação homóloga mediada ¹⁶ da cassete seleccionável amplificado de ADN marcador de fragmentos gerados por PCR, para criar não essenciais mutantes de deleção de genes (secção 1.1), ou de genes essenciais hypomorphic estirpes dadoras mutante (secção 1.2), que são então utilizados como "consultas" para definir redes GI.

Nota: Durante o processo de desenvolvimento....