Formuleringar för frystorkning av bakterier och deras inverkan på cellöverlevnad
Summary
Frystorkning är ofta ett enkelt och bekvämt sätt för att erhålla torra produkter av viabla bakterieceller. En fråga av processen är cellöverlevnad. Vi detalj här ett förfarande för att undersöka hur cellens överlevnad under frystorkning påverkas av egenskaperna hos den använda formuleringen.
Abstract
Cellulär vatten kan tas bort för att reversibelt inaktivera mikroorganismer för att underlätta lagring. Ett sådant förfarande för avlägsnande är frystorkning, vilket anses vara en mild uttorkning metod. För att underlätta cellöverlevnad under torkning, cellerna formuleras ofta förväg. Formuleringen bildar en matris som bäddar in cellerna och skyddar dem från olika skadliga påkänningar på cellerna under frysning och torkning. Vi presenterar här en generell metod för att utvärdera överlevnaden av celler efter frystorkning och vi illustrera det genom att jämföra resultaten med fyra olika formuleringar: disackariden sackaros av sackaros härledda polymeren Ficoll PM400, och respektive polysackarider hydroxietylcellulosa (HEC ) och hydroxipropylmetylcellulosa (HPMC), på två stammar av bakterier, P. putida KT2440 och A. chlorophenolicus A6. I detta arbete har vi illustrera hur man förbereder formuleringar för frystorkning och hur man kan undersöka mekaismer av cellens överlevnad efter rehydrering genom att karaktärisera formuleringen hjälp av differentialscanningkalorimetri (DSC), ytmätningar spänning, röntgen analys och elektronmikroskopi och relatera dessa data till överlevnad. Polymererna valdes för att få en monomer struktur av respektive polysackarid liknar sackaros till en varierande grad. Med denna metod inställning visade vi att polymerer kan stödja cellöverlevnad så effektivt som disackarider om vissa fysikaliska egenskaper hos formuleringen styrs 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Motivet för denna studie var att undersöka några formuleringsegenskaper som kan vara av betydelse för cellens överlevnad under frystorkning. Även om den inneboende torkning toleransen varierar mellan olika arter, såsom illustreras i figur 1A, trenden på hur väl de olika formuleringar stödcellen överlevnad är likartad. Det är upplysande att börja med en jämförelse av sackaros och Ficoll. Man tror att en viktig faktor för en formulering för att stödja cellöverlevnad är förmågan av f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet stöddes av Svenska Stiftelsen för miljöstrategisk forskning (MISTRA) via DOM-programmet och Grant 211684 (BACSIN) från Europeiska unionen gemenskapens FP7 ramprogram. Vi tackar J. Engstrand om hjälp med att filma röntgen analys och L. Tang för att hjälpa till med den konceptuella berättande.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Ficoll PM 400 | GE-healthcare | 17-0300-10 | |
| HEC (Natrosol-M Pharm Grade) | Ashland | Gift from Ashland | |
| HPMC (Methocel F4M) | Dow | Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S2395 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| Tryptic Soy broth | Merck | 105459 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck | 105458 | |
| Lyostar II | FTS Kinetics | N.A. | |
| Pyris Diamond DSC | Perkin-Elmer | N.A. | |
| Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer | Bruker | N.A | |
| Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM | FEI | N.A | |
| Krüss Educational Tensiometer | Krüss | N.A. |
References
- Wessman, P., Mahlin, D., et al. Impact of matrix properties on the survival of freeze-dried bacteria. J. Sci. Food Agric. 91 (14), 2518-2528 (2011).
- Ablett, S., Izzard, M. J., et al. Differential Scanning Calorimetric Study of Frozen Sucrose and Glycerol Solutions. Journal of the Chemical Society-Faraday Transactions. 88 (6), 789-794 (1992).
- Knopp, S. A., Chongprasert, S., et al. The relationship between type TMDSC curve of frozen sucrose solutions and collapse during freeze-drying. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 54 (2), 659-672 (1998).
- Crowe, J. H., Leslie, S. B., et al. Is Vitrification Sufficient to Preserve Liposomes during Freeze-Drying. Cryobiology. 31 (4), 355-366 (1994).
- Jain, P., Sen, S., et al. Effect of glass-forming biopreservatives on head group rotational dynamics in freeze-dried phospholipid bilayers: A P-31 NMR study. Journal of Chemical Physics. 131 (2), (2009).
- Stock, J. B., Rauch, B., et al. Periplasmic Space in Salmonella-Typhimurium and Escherichia-Coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (21), 7850-7861 (1977).
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., et al. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54, 579-599 (1992).
- Leslie, S. B., Israeli, E., et al. Trehalose and Sucrose Protect Both Membranes and Proteins in Intact Bacteria during Drying. Applied and Environmental Microbiology. 61 (10), 3592-3597 (1995).
- Nesarikar, V. V., Nassar, M. N. Effect of cations and anions on glass transition temperatures in excipient solutions. Pharmaceutical Development and Technology. 12 (3), 259-264 (2007).
- You, Y., Ludescher, R. D. The effect of sodium chloride on molecular mobility in amorphous sucrose detected by phosphorescence from the triplet probe erythrosin B. Carbohydr. Res. 343 (2), 350-363 (2008).
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Nguyen, K. H. N., Crowe, L. M. Is vitrification involved in depression of the phase transition temperature in dry phospholipids. Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1280, 187-196 (1996).
