שיטת המפלצת הירוקה מאפשרת הרכבה המהירה של מחיקות מרובות מסומנות בחלבון כתב גן קידוד ירוק זרחני. שיטה זו מבוססת על נהיגת זני שמרים במחזורים חוזרים ונשנים של מגוון מיני של מחיקות והעשרה פלואורסצנטי המבוסס של תאים שנשאו יותר מחיקות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תהליך המפלצת הירוקה לדור של זני שמרי נשיאת מחיקות Gene מרובות
במאמר זה
סיכום
תקציר
פנוטיפים למחיקת גן לעתים קרובות מתגלים רק כאשר המוטציה נבדקת ברקע גנטי מסוים או 1,2 תנאי הסביבה. ישנן דוגמאות שבו גנים רבים זקוקות למחיקה לחשוף פונקציות גנים נסתרות 3,4. למרות הפוטנציאל לתגליות חשובות, אינטראקציות הקשורים בשלושה או יותר גנים נחקרו במידה רבה. חיפושים הממצים של אינטראקציות מרובות מוטציה יהיו מעשיים בשל המספר העצום של צירופים אפשריים של מחיקות. עם זאת, מחקרים של קבוצות נבחרות של גנים, כגון ערכות של paralogs עם יותר סיכוי מראש של שיתוף פעולה משותפת, יהיו אינפורמטיבי.
בcerevisiae Saccharomyces השמרים, נוקאאוט הגן מושג על ידי החלפת גנים עם סמן בחירה באמצעות רקומבינציה הומולוגית. מכיוון שמספר הסמנים הוא מוגבל, פותחו שיטות להסרה ושימוש חוזר בסם סמן הדואר 5,6,7,8,9,10. עם זאת, ברצף מוטציות רבות הנדסיות באמצעות שיטות אלה הן זמן רב משום שהזמן דרוש ליניארית קשקשים עם מספר המחיקות להיות שנוצר.
כאן אנו מתארים שיטת המפלצת הירוקה להנדסת מחיקות מרובות באופן שגרתי בשמרי 11. בשיטה זו, כתב חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שולב מחיקות משמש לכמותית זני תווית בהתאם למספר של מחיקות כלולות בכל מאמץ (איור 1). סיבובים חוזרים ונשנים של מבחר של GFP-מסומנים מחיקות באמצעות הזדווגות שמרים ומיוזה יחד עם העשרת הזרימה cytometric של זנים נושאים יותר של המחיקות הללו מובילות להצטברות של מחיקות בזנים (איור 2). ביצוע מספר רבים של תהליכים במקבילים, כאשר כל תהליך שילוב מחיקות אחד או יותר בכל סבב, מפחית את הזמן הנדרש לבניית מתח. תוכן "> הצעד הראשון הוא יכין מוטציות בודדות ההפלואידים כינו 'ProMonsters," כל אחד מהם נושא את כתב ה-GFP במוקד נמחק ואחד' ארגז הכלים 'הלוקוסים-או GMToolkit-המפלצת הירוקה או GMToolkit-α ב . Can1Δ לוקוס (איור 3) שימוש בזנים מאוסף מחיקת שמרי 12, מחיקות GFP-מסומנות יכול להיות שנוצר בנוחות על ידי החלפת KanMX4 הקלטת המשותפת קיימת בזנים אלה עם GFP אוניברסלי - URA3 בר כל GMToolkit מכיל:. או - או α-הזדווגות סוג ספציפי סמן הפלואידים בחירה 1 ובדיוק אחד משני הסמנים ש, כאשר שני GMToolkits נמצא, באופן קולקטיבי מאפשרים בחירה של diploids.
הצעד השני הוא לבצע רכיבה המינית שדרכו ניתן לשלב לוקוסי מחיקה בתוך תא בודד על ידי מבחר האקראי ו / או recomb meioticination המלווה כל מחזור של הזדווגות ונביגה.
פרוטוקול
1. דור של ProMonsters
- הכן את קלטת החלפת GFP האוניברסלית על ידי הגברת TETO סמן 2-GFP וסמן URA3 מpYOGM012 פלסמיד (התנגדות אמפיצילין) תוך שימוש בפריימרים עם רצפים:
GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG וGGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT (אזורים מודגשים לספק הומולוגיה לאזורי האיגוף של קלטת KanMX4 מאפשרת החלפה ממוקדת). תגובת PCR צריכה להתבצע עם פולימראז Phusion, מאגר HF, וsulfoxide דימתיל 3% (....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאשר מתח-הפלואידים נושאים ארבע מחיקות מסומנות-GFP (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) נחצה עם מתח α-הפלואידים נושאים ארבע מחיקות (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), עם שתי מחיקות (ycl033cΔ yer042wΔ) משותף לשני זנים, נציג תוצאה הושגה. תערובת ההזדווגות הייתה בתרבית במדיום המכיל YPDA G418 ונט כדי לבחור diploids. את diploids התוצאה הייתה בתרבית במדיום נביגה. הנבגים פוזרו על ידי הטיפול וsonication zymolyase, וניבטו בתקשורת בחירת ההפלואידים. התאים אז הם ש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כפי שפתחנו את גישת המפלצת הירוקה, שהעסקנו אותנו לאפשרות של רקומבינציה בין קלטות החלפת GFP שונות, שהוביל לארגון מחדש הגנום. מקלים נגד האפשרות הזאת הוא הבחירה שלנו לתאים שעברו סבבים רבים של הזדווגות ומיוזה בהצלחה. תאים הנושאים הגנום סודר מחדש צפויים להיות בכושר ירוד לאחר הזדווגות לתאים בלי סידור מחדש זהה. ואכן, אנו לא צופים כל חוסר יציבות הגנום כתוצאה מרקומבינציה בין קלטות GFP 11. עם זאת, אנחנו לא יכולים לשלול לחלוטין את האפשרות הזאת, ולכן מומלץ שמשתמשת לבדוק את הזנים שנו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי חוזה ההגנה האמריקנית המחקר המתקדם פרויקטי סוכנות N66001-12-C-4039 לי"ש, מענק של פ אלפרד סלואן הקרן לRSL, והמוסד אמריקאי הלאומי לבריאות מענקי R01 HG003224 וR21 CA130266 לFPRFPR היה גם נתמך על ידי מלגה מהמכון הקנדי למחקר מתקדם ועל ידי תכנית מחקר כיסאות אקסלנס קנדה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שמו של המגיב או המכשיר | חברה | מספר קטלוגים | תגובות (אופציונלי) |
| G418 | סיגמה אולדריץ | A1720 | מתמוסס במים ומסננים לעקר (מסנן 0.2-מיקרומטר). ריכוז המלאי: 200 מ"ג / מ"ל. לאחסן ב 4 ° C. |
| ClonNAT (nourseothricin) | Bioagents רנר | 5001000 | מתמוסס במים ומסננים לעקר (מסנן 0.2-מיקרומטר). ריכוז המלאי: 100 מ"ג / מ"ל. לאחסן ב 4 ° C. |
| דוקסיציקלין | סיגמה אולדריץ | D9891 | להמס באתנול 50% ולסנן-לעקר (מסנן 0.2-מיקרומטר). ריכוז המלאי: 10 מ"ג / מ"ל. הפוך טרי מדי ארבעה שבועות. חומה מאור עם רדיד אלומיניום ולאחסן ב 4 ° C. |
| Zymolyase | ZymoResearch | E1005 | |
| Difco בסיס w / o חומצות אמין חנקן שמרים | BD | 291940 | |
| (מסובב לצינורות) אקדח | Labnet | H5600 | |
| יחידת אלקטרופורזה XL ג'ל אנדורו | Labnet | E0160 | |
| Sonifier 450 | ברנסון | 101-063-198 | |
| Microtip לSonifier 450 | ברנסון | 101-148-062 | |
| סדרן התא FACSAria | BD | ||
| סדרן התא MoFlo | Beckman-קולטר | ||
| Biomek FX או רובוט מקביל | Beckman Coulter | אופציונלי. להקמת PCRs genotyping. |
מקורות
- Tong, A. H., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science's STKE. 294, 2364-23 (2001).
- Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Scie....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
