RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Özet

Floresan In situ hibridizasyon (FISH) bu tür birden fazla üyesinin eşzamanlı olarak transkripsiyon aktivitesi polijenik analizinin yapılmasını mümkün kılar Var Multigen aile Plasmodium falciparum Enfekte eritrositler ¹. Bu teknik uyarlanabilir ve genler, hücreler ve organizmalar farklı türlerde kullanılır.

Özet

Sıtma enfeksiyonları sırasında insan endotel reseptörlerine Plasmodium falciparum enfekte eritrositler (IE) Yapışma var genler tarafından kodlanan PfEMP1 protein varyantları ifade aracılık etmektedir.

Haploid P. falciparum genom tek bir enfeksiyonun kan aşaması sırasında her defasında hücre başına transkribe olduğu düşünülmektedir edilmiş olan yaklaşık 60 farklı var genler barındırır. Nasıl var gen transkripsiyonu gibi birbirini dışlayan düzenleme elde edilir belirsizdir, bireysel var genleri veya P. klinik sonuçlar üzerinde farklı reseptörleri ve diferansiyel bağlama sonucu ile ilişkili var genlerin alt gruplarının tanımlanmasıdır falciparum enfeksiyonlar. Son zamanlarda, birbirini dışlayan transkripsiyon paradigması bireysel P. esas transkripsiyon analizleri ile şüphe içine adı olmuştur Tek inf içinde falciparum transkript tespitiP. bireysel çekirdeklerinde parazit var gen transkripsiyonu in situ hibridizasyon RNA floresan kullanarak ected eritrotik hücreleri (FISH) analizi falciparum IE ^1.

Burada, P. tek-çekirdekleri var in gen transkripsiyonu analizi için RNA FISH yöntemi gerçekleştirmek için bir protokol ayrıntılı sunmak falciparum insan eritrosit etkilemiştir. Yönteminin kullanımını esas digoxigenin-ve TSA Artı Flüoresans Palet Sistemi ² (Perkin Elmer), mikroskopik analiz ile taze seçilmiş S. antisens RNA probları kullanılarak biyotin-etiketli falciparum IE. In situ hibridizasyon metodu ile de P. farklı aşamaları sırasında ifade edilen genlerin transkripsiyonu ve çeşitli düzenleme izlemek için kullanılabilecek falciparum yaşam döngüsü ve diğer sıtma parazit türlerinin ve diğer organizmalar ve hücre tipleri uyarlanabilir.

Protokol

1. Taze Seçilen Enfekte Eritrositler Nesil

PfEMP1 proteininin yüzeyde ekspresyonu için seçilen taze kültür kullanılarak, bu test için, en iyi sonuçlar elde edilir. Bu özel deney 3D7 P. falciparum soyu önce ¹ açıklandığı gibi spesifik antikorlar kullanılarak seçildi.

1. Gün

1. Bir S. dan paketlenmiş kan hücrelerinin hasat 200 ul falciparum kültürü oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj ile% 2-5 geç safha IE içeren.
2. 37. 2 ml kan pelet yeniden askıya ° C sıcak% 0.75 jelatin bir steril 14 ml tüp içinde çözelti ve tortu ile enfekte olmamış ve ....

Sonuçlar

Şekil 1, büyük adımlar ve RNA FISH yöntemin zaman süresinin bir akış şeması gösterilmektedir.

Tek P. kullanarak iyi ve kötü korunmuş lekeli mRNA BALIK deneyler temsili görüntüleri bir dizi falciparum IE Şekil 2 'de gösterilmiştir. Bu intrasellüler protozoon DAPI ile mavi lekeli bir küçük (1-1.5 mikron çapında) çekirdeğe sahip. Yirmi dört saat P. eritrosit işgalinden sonra falciparum schizogony, yani nükleer bö.......

Tartışma

RNA FISH analizi, bu gibi Northern blot ve RT-PCR gibi yöntemlerin tersine, tek bir hücre düzeyinde spesifik mRNA transkriptlerinin ayrımı izin verir. Bu, P., bu örnekte, bu mümkün transkripsiyonel olarak aktif ve aktif olmayan hücreler arasında ayrım yapan falciparum parazitik insan kırmızı kan hücreleri içinde protozoa. Böyle tam hücreli gözlemler genelde gereklidir ve önemlidir ve roman transkripsiyonel desenler ¹ çözülmeye olabilir.

Diğer RNA FISH yöntemler <.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Asetik asit	Sigma / Aldrich	338826-100ml
Albumax medya: RPMI 1640 Glutamine çözümü	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 5 ml çözelti glutamin
Albumax medya: Gentamisin sülfat Albumax-çözüm	Lonza	BE02-012E	2.5 ml gentamisin sülfat 50 ml Albumax çözelti
Albumax çözelti: Hipoksantin	Sigma-Aldrich	H9377	0,8 g Hipoksantin
Albumax çözelti: AlbuMAX II	Bennvitrogen	11021-037	200 g Albumax
Albumax çözelti: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	4 litre RPMI 1640 Max mıknatıslı çözülür. 50 ° C. Filtre sterilize ve alikotları -20 ° C'de saklayın.
Amberlit	Sigma	A5710-110G'nin	Formamid Deiyonize için Reçine.
Anti-biotin keçi pAb Peroksidaz Konjugat	Calbiochem	203206
Anti-Dig antikoru	Novus Biyolojik	NB100-41330
DAPI ile Anti-solmaya reaktifi	Invitrogen	P36931	Montaj medya tamamen slayt sızdırmazlık önce 24 saat boyunca tedavi vardır.
Biotin RNA Etiketleme Mix	Roche	11685597910
Kamera dijital	Nikon dijital görme DC-F11
Lameller	Menzel-Glaser	631-1570
kültürü şişesi 25 cm 2 Nunclon yüzey	Nunc	156340
DEPC	Fluka / Sigma	32490-100ml	1000 ml su içinde deinonized 1 mL DEPC. Bir karıştırma çubuğu ekleyin ve 12 saat için karıştırın. 30 dakika süreyle otoklav.
Dijital fotoğraf makinesi	Nikon dijital görme DC-F11
Dynabeads Protein A	Invitrogen	10002D
DynaMaq-15 Mıknatıs	Invitrogen	123-01D
Formamid bioultra 99%	Fluka/ Sigma	47671-1l-F	Deiyonize formamid: formamid 100 ml iyon değiştirme reçinesi 5 g. 30 dakika karıştırın. Whatman kağıt süzülür.
. Jelatin 0 75% çözüm: Jelatin	Sigma-Aldrich	G2500	500 ml RPMI 1640 içerisinde 3.75 g jelatin. 56 Isı ° C eritin. Zaman 56 ° C sterilize Filtre Alikots içinde -20 ° C'de saklayın.
. Jelatin 0 75% çözüm: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 içerisinde 3.75 g jelatin. 56 Isı ° C eritin. Zaman 56 ° C sterilize Filtre Alikots içinde -20 ° C'de saklayın.
Glutamin çözüm: L-glutamin	Sigma-Aldrich	G3126	500 ml% 0,9 NaCl içinde 14,6 g L glutamin. Dağılma, filtre sterilize ve alikotları -20 ° C'de saklayın.
Glutamin çözüm: HCl	Sigma	H1758	500 ml% 0,9 NaCl içinde 14,6 g L glutamin. Dağılma, sterilize filtre ve alikotları -20 ° C'de saklayın.
Hibritleşme çözüm: Formamid Bio ultra% 99 SSC 20x	Fluka / Sigma	47671-1l-F	Toplam 20 ml -20 donmuş tutmak ° C alikotları 10 ml deiyonize formamid
Hibritleşme çözüm: Denhardt kullanıcısının 50x konsantresi	Sigma	D2532	5ml 20xSSC
Hibritleşme çözüm: Maya tRNARoche engelleme reaktif	Sigma	R-6750	2 ml 50x Denhardt sitesi Ml maya tRNA başına 250 ul 20 mg
Hibridizasyon çözümü Trong	Fluka / Sigma	31149-106GF	0,4 g Roche reaktif engelleme Ml somon spermi DNA başına 10 mg (: denatüre somon spermDNA 96 5 dakika için ° C hibridizasyon çözeltisi ilave edilmeden önce Kritik) 1 mL
Hybridizer Thermostar 100 HC4	Quantifoil Instruments GmbH	1004-0011	Hibridizasyon fırın ve DEPC su ile doldurulur RNaz ücretsiz hibridizasyon odaları tarafından değiştirilebilir.
Daldırma yağı UV şeffaf floresans ücretsiz	Sigma	10976-1EA
İmmünofloresan veya konfokal mikroskop	Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish	Herhangi bir eczane mevcuttur
PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC deiyonize H 2 O			PH 7.4 'e Ajust 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l
Paraformaldehyde 4%	Fluka / Chemika	76240	80 ml PBS / DEPC içinde 4 g PFA. PFA eriyene ° C kadar 65 Isı. 20 ml PBS ekleyin, çözüm soğumasını bekleyin. PH 7.4 'e ayarlayın. Filtre. -20 ° C'de alikotları Mağaza
Paraformaldehyde% 4 / Asit asetik 5%			950 ul paraformaldhyde + 50 ul asetik asit
Pepsin	Sigma / Aldrich	P7000
Peroksidaz-konjuge anti-biotin	Calbiochem	203206
RBC yıkama ortamı: RPMI 1640 Glutamine çözümü	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 çözeltisi 5 ml glutamin
RBC yıkama ortamı: Gentamisin sülfat	Lonza	BE02-012E	2.5 ml gentamisin sülfat
RNaz	Sigma / Aldrich		Bir 10 mg / ml stok çözeltisi edin.
RNaz ücretsiz 1.5 ml tüp	Ambion	AM12450
RNaz Zap	Ambion	AM9780
11mm 4 kuyu Slaytlar	Thermo Scientific	MENZXER306W
SSC 20x: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	3 M NaCl (175 g / l), 0,3 M Na sitrat, 3 x H2O (88 g / l), 1M HCI ile pH 7.0 'a ayarlayın
SSC 20x: Sodyum sitrat dihidrat	Sigma / aldrich	W302600	3 M NaCl (175 g / l), 0,3 M Na sitrat, 3 x H2O (88 g / l), 1M HCI ile pH 7.0 'a ayarlayın
SSPE 20x: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH 2 PO 4	Sigma / Aldrich	S0751	27.6 g NaH 2 PO 4.
SSPE 20x: 4 EDTA toz			9.4 g EDTA tozu DEPC su ekleyin, pH 7.4 ayarlayın. Oto20 dakika için Clave
TNB tampon: TNT tampon			10 ml tampon TNT
TNB tampon: Engelleme reaktifi			0.05g Engelleme reaktifi Bloke edici reaktif çözmek için, bir taraftan karıştırılarak bir saat süreyle 60 ° C ila çözelti ısıtın. -20 ° C'de saklayın (Perkin Elmer TSA-protokol türetilen.)
TNT tamponu: Tris / HCl	Sigma	T1503	1 M Tris / HCl, pH 8.0
TNT tamponu: NaCl	Sigma Aldrich	S9625	100 ml
TNT tamponu: Tween20	Sigma	93773	5 M NaCl içeren 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml Oda sıcaklığında, pH 7.5 'e ayarlayın. (Perkin Elmer TSA-protokol türetilen.)
TSA artı Cyanine3 / Floresein sistemi	Perkin Elmer	NEL753000IKT	Deney başlamadan önce dikkatlice TSA Artı Flüoresans Palet Sistemi protokolü okuyun.
Steril tüpler 14 ml	Almeco - CM LAB Aps	91016