HHステージ10ニワトリ胚のOVOエレクトロポレーションで

Summary

卵エレクトロポレーションのニワトリは、鳥類胚の遺伝子操作を可能にする技術です。この技法の一般的なアプリケーションは、遺伝子と推定エンハンサーエレメントの機能解析が含まれています。このビデオでは、HH 10ニワトリ胚の神経管のエレクトロポレーションを示しています。注入法と適切な卵の取り扱いが議論されています。

Abstract

大きいサイズとニワトリの胚の外部開発は長い間その発生生物学の研究に貴重なツールてきた。分子生物学的手法の出現で、ひよこは、遺伝子調節と機能を研究するために有用なシステムとなっています。開発ニワトリ胚へのDNAまたはRNAの構造をelectroporatingことにより、遺伝子が発現したり、in vivoでの遺伝子機能で分析するためにノックダウンすることができます。同様に、レポーターコンストラクトは、運命のマッピングに使用することができますまたは推定される遺伝子調節エレメントを調べることができます。マウスで同様の実験と比較すると、ひよこのエレクトロポレーションは、迅速、簡単かつ安価であるという利点を持っています。このビデオでは、胚を操作するために卵殻にウィンドウを作る方法を第一を示しています。次に、胚は、胚の下に注入されたインドのインクの希釈溶液で可視化です。ガラス針とピペットを開発神経管にDNAとファストグリーン色素を注入するために使用され、その後、白金電極を胚に平行に配置され、短い電気パルスは、パルス発生器で投与されています。最後に、卵をテープで密封され、さらなる発展のためにインキュベーターに戻されます。さらに、ビデオは、適切な卵の保管と取り扱いを示し、胚損失、以下のエレクトロポレーションの原因を説明します。

Protocol

卵の取り扱い卵は生存率の大幅な損失（小さなワインクーラーは、この目的のために理想的です）のないインキュベーションの1週間前までに13 ° Cに保つことができる。 インキュベーターは、37.8℃（100 ° F）を設定した加湿鶏肉の代わりにし、卵は室温に戻して、インキュベーションの前に。 我々は通常、胚がハンバーガーとハミルトンのステージ10に到達したインキュ?…

Discussion

このプロトコルは、HH10のニワトリ胚の神経管のエレクトロポレーションにステップバイステップガイドを提供します。手法を示すことに加えて、ストレージと卵の処理のためのガイドラインも提供されています。この手法は、遺伝学的解析のための広範囲なアプリケーションを持っており、実験の容易さと低コストは、多くのラボのためのそれらを実現可能になります。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Chicken egg incubator				humidified, set to 37.80°C (100F).
Pulse generator		Genetronics	BTX T820	Square wave generator or comparable
Electrodes				our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart
Connecter cables
Micromanipulator
Dissecting scope				with large working distance
Glass capillaries				and capillary puller or commercial glass needles
Leibovitz’s L-15 media
chicken eggs				fertilized
Curved scissors
10 ml syringe
Large bore needle				16-18G
Mouth pipette
India ink
Insulin syringe/syringe
Plasmid DNA				≥ 1µg/µl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye