I Ovo Electroporations av HH Stage 10 kycklingembryon

Summary

Chick i ovo elektroporering är en teknik som möjliggör genetisk manipulation av aviär embryot. Vanliga tillämpningar av denna teknik med funktionell analys av gener och förmodade förstärkare element. Denna video visar neuralrörsdefekter elektroporation i HH 10 kycklingembryon. Injektionsteknik och korrekt ägg hantering diskuteras.

Abstract

Stor storlek och extern utveckling av kyckling embryot har länge gjort det ett värdefullt verktyg för att studera utvecklingsbiologi. Med tillkomsten av molekylärbiologiska tekniker, har ungen blivit ett användbart system där för att studera genreglering och funktion. Genom electroporating DNA eller RNA konstruktioner i utvecklingsländerna kyckling embryot kan gener uttryckas eller slås ned för att analysera in vivo geners funktion. Likaså kan reporter konstruktioner användas för ödet kartläggning eller för att undersöka förmodade gen reglerande element. Jämfört med liknande experiment i mus, har chick elektroporation fördelarna med att vara snabbt, enkelt och billigt. Denna video visar först hur att göra ett fönster i äggskalet att manipulera embryot. Därefter är embryot visualiseras med en utspädd lösning av tusch injiceras under embryot. Ett glas nål och pipett används för att injicera DNA och Fast grönt färgämne i utvecklingsländerna neuralrörsdefekter, då platina elektroder placeras parallellt med embryot och korta elektriska pulser ges tillsammans med en pulsgenerator. Slutligen är ägget förseglade med tejp och läggs tillbaka i en inkubator för vidare utveckling. Dessutom visar videon korrekt ägget lagring och hantering och diskuterar möjliga orsaker till embryoförlust efter elektroporation.

Protocol

Egg hantering Ägg kan förvaras vid 13 ° C i upp till en vecka före inkubation utan betydande förlust av livskraft (en liten vinkyl är perfekt för detta ändamål). Innan inkubation, låt ägg till rumstemperatur och placeras sedan i en fuktig kyckling inkubator inställd på 37,8 ° C (100 ° F). Vi electroporate brukar embryon ungefär 48 timmar från starten av inkubationstiden, när embryot har nått Hamburger och Hamilton steg 10. Tid för inkubationstiden kan variera b…

Discussion

Detta protokoll ger en steg för steg guide till neuralrörsdefekter elektroporering av HH10 kycklingembryon. Förutom att visa tekniken, är riktlinjer för lagring och hantering av äggen också. Denna teknik har ett brett spektrum av tillämpningar för genetisk analys och den lätthet och låg kostnad av experiment gör dem möjliga för många laboratorier.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Chicken egg incubator				humidified, set to 37.80°C (100F).
Pulse generator		Genetronics	BTX T820	Square wave generator or comparable
Electrodes				our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart
Connecter cables
Micromanipulator
Dissecting scope				with large working distance
Glass capillaries				and capillary puller or commercial glass needles
Leibovitz’s L-15 media
chicken eggs				fertilized
Curved scissors
10 ml syringe
Large bore needle				16-18G
Mouth pipette
India ink
Insulin syringe/syringe
Plasmid DNA				≥ 1µg/µl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye