الحنق المجهر لمراقبة الوقت الحقيقي من أحداث في اشارة الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار Unimolecular
Summary
فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) هو تقنية المجهر قوية لمراقبة الوقت الحقيقي من الأحداث يشير في الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار المختلفة وصحفيين. هنا نحن تصف كيفية بناء epifluorescence مخصصة الحنق نظام التصوير من المكونات المتوفرة تجاريا وكيفية استخدامها لتجارب الحنق.
Abstract
فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) المجهر تواصل كسب اهتمام متزايد كأسلوب لمراقبة الوقت الحقيقي من الأحداث البيوكيميائية ويشير في الخلايا الحية والأنسجة. بالمقارنة مع الأساليب الكلاسيكية البيوكيميائية، وتتميز هذه التكنولوجيا رواية عالية الدقة الزمنية والمكانية. الحنق تجارب استخدام مختلف وراثيا ترميز أجهزة الاستشعار التي يمكن التعبير عنها وتصويرها على مر الزمن في الموقع أو في الجسم الحي 1-2. يمكن أجهزة الاستشعار التقليدية تقريرا إما البروتين البروتين التفاعلات عن طريق قياس الحنق بين زوج fluorophore الموسومة البروتينات أو تغييرات في بتكوين بروتين واحد الذي يؤوي المانحة ومتقبل fluorophores مترابطة مع شاردة ملزمة لجزيء من مصلحة 3-4. أجهزة الاستشعار عن ثنائي الجزيء البروتين البروتين التفاعلات تشمل، على سبيل المثال، يبني مصممة لرصد بروتين G-التنشيط في خلايا 5، في حين أن أجهزة الاستشعار unimolecular شركة طيران الشرق الأوسطوتستخدم على نطاق واسع التغيرات بتكوين suring لرسل الصورة الثانية مثل الكالسيوم 6، مخيم 7-8، الفوسفات اينوزيتول 9 و المركب 10-11. هنا نحن تصف كيفية بناء epifluorescence مخصصة الحنق نظام التصوير من واحد المكونات المتوفرة تجاريا وكيفية السيطرة على كامل الإعداد باستخدام مجانية الصغرى، مدير. تم تصميم هذه الأداة بسيطة ولكنها قوية لقياسات روتينية أو أكثر تطورا الحنق في الخلايا الحية. تتم معالجة الصور باستخدام المكتسبة الذاتية المكتوبة المكونات الإضافية لرؤية التغييرات في نسبة الحنق في الوقت الحقيقي في أي تجارب قبل أن يتم تخزينها في شكل رسومات متوافقة مع البناء في يماغيج مجانية المستخدمة لتحليل البيانات اللاحقة. ويتميز هذا النظام منخفضة التكلفة من مرونة عالية، ويمكن استخدامها بنجاح لرصد الأحداث البيوكيميائية المختلفة والجزيئات يشير من قبل عدد كبير من أجهزة الاستشعار المتاحة الحنق في الخلايا الحية والأنسجة. وكمثال على ذلك، علينا أن نبرهن حآه لاستخدام هذا النظام لأداء التصوير في الوقت الحقيقي رصد المخيم في الخلايا الحية على التحفيز 293A مع مستقبلات β ناهض الأدرينالية ومانع.
Protocol
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن لشرح كيفية بناء نظام التصوير بسيطة منخفضة التكلفة ولكنها قوية للتطبيقات الروتينية الحنق مع مجموعة متنوعة من أجهزة الاستشعار المتاحة. تم تصميم نظام المعروضة هنا لCFP وYFP، أو أنواع مماثلة من البروتينات الفلورية، حيث يتحرك هذا الزوج المانحين متق…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر انكه Rüttgeroth وزيمرمان كارينا للمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (NI 1301/1-1 منحة لVON) وجامعة غوتنغن المركز الطبي ("برو FUTURA" منحة لVON).
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
- Zaccolo, M. Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ. Res. 94, 866-873 (2004).
- Mehta, S., Zhang, J. Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems. Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).
- Miyawaki, A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).
- Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578, 55-67 (2007).
- Willoughby, D., Cooper, D. M. Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).
- Tanimura, A. Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations. J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells. Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).
- Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).
- Borner, S. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).
- Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells. BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).
- Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. PLoS One. 4, e6036 (2009).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin. Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).
- Aoki, K., Matsuda, M. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).
