FRET микроскопии для мониторинга в реальном времени сигнальных событий в живых клетках Использование Мономолекулярные Биосенсоры
Summary
Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) микроскопия является мощным средством для мониторинга в реальном времени сигнальных событий в живых клетках с помощью различных биосенсоров, как журналисты. Здесь мы опишем, как создать индивидуальный эпифлуоресцентной FRET системы формирования изображения из коммерчески доступных компонентов и как использовать его для FRET экспериментов.
Abstract
Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) микроскопии продолжает набирать все больший интерес как метод для мониторинга в реальном времени биохимических и сигнальных событий в живых клетках и тканях. По сравнению с классическими биохимическими методами, эта новая технология характеризуется высоким временным и пространственным разрешением. FRET экспериментах используют различные генетически закодированный биосенсоры, которые могут быть выражены и отображаемого с течением времени на месте или в естественных условиях 1-2. Типичные биосенсоров может либо сообщить белок-белковых взаимодействий путем измерения FRET между флуорофором с метками пары белков или конформационных изменений в единый белок, который питает донора и акцептора флуорофоров взаимосвязаны с обязательным фрагментом для молекулы интереса 3-4. Бимолекулярные биосенсоры для белок-белковых взаимодействий относятся, например, строит, предназначенная для контроля G-белок активации в клетках 5, в то время как мономолекулярный датчики измеренияSuring конформационные изменения, которые широко используются для изображения вторичные мессенджеры, такие как кальций 6, цАМФ 7-8, инозитфосфатов 9 и цГМФ 10-11. Здесь мы опишем, как создать индивидуальный эпифлуоресцентной FRET система визуализации от одного коммерчески доступных компонентов и, как контролировать все настройки с помощью Micro-менеджер бесплатно. Этот простой, но мощный инструмент предназначен для регулярного или более сложные FRET измерений в живых клетках. Полученные изображения обрабатываются с помощью самостоятельной письменной плагинов для визуализации изменений в соотношении FRET в режиме реального времени во время любых экспериментов перед сохранением в графическом формате совместимым с встроенным в ImageJ бесплатной использованы для последующего анализа данных. Эта недорогая система характеризуется высокой гибкостью и могут быть успешно использованы для мониторинга различных биохимических событий и сигнальные молекулы множество доступных FRET биосенсоров в живых клетках и тканях. В качестве примера мы покажем, чвл использовать это изображение системы для выполнения мониторинга в реальном времени цАМФ в клетках живых 293А при стимуляции β-адренорецепторов агонистов рецепторов и блокатора.
Protocol
Discussion
В этом протоколе, мы покажем, как построить простой недорогой, но мощный FRET системы визуализации для обычных приложений с различных доступных биосенсоров. Система, представленная здесь, предназначена для CFP и YFP или аналогичных типов флуоресцентных белков, как донорно-акцепторных пар. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Анке Rüttgeroth и Карина Zimmermann для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (грант NI 1301/1-1 фон) и Геттингенском университете Медицинского Центра ("за Futura" грант VON).
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
- Zaccolo, M. Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ. Res. 94, 866-873 (2004).
- Mehta, S., Zhang, J. Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems. Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).
- Miyawaki, A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).
- Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578, 55-67 (2007).
- Willoughby, D., Cooper, D. M. Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).
- Tanimura, A. Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations. J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells. Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).
- Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).
- Borner, S. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).
- Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells. BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).
- Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. PLoS One. 4, e6036 (2009).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin. Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).
- Aoki, K., Matsuda, M. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).
