FRET microscopie pour Surveillance en temps réel des événements de signalisation dans les cellules vivantes en utilisant Biocapteurs unimoléculaires
Summary
Förster énergie de résonance de transfert (FRET) microscopie est une technique puissante pour surveiller en temps réel des événements de signalisation dans les cellules vivantes en utilisant différents biocapteurs en tant que journalistes. Ici, nous décrivons comment construire un épifluorescence personnalisée FRET système d'imagerie à partir de composants disponibles dans le commerce et la façon de l'utiliser pour des expériences de FRET.
Abstract
Förster énergie de résonance de transfert (FRET) microscopie continue de gagner un intérêt croissant en tant que technique de suivi en temps réel des événements biochimiques et de signalisation dans les cellules vivantes et les tissus. Par rapport aux méthodes classiques biochimiques, cette nouvelle technologie est caractérisée par la résolution temporelle et spatiale. Expériences de FRET utiliser différents génétiquement codés biocapteurs qui peuvent être exprimées et imagée au fil du temps in situ ou in vivo 1-2. Biocapteurs typiques peuvent signaler supporte interactions protéine-protéine par mesure de FRET entre une paire fluorophore marqué de protéines ou de changements conformationnels de la protéine unique qui abrite donneur et fluorophores accepteurs reliés entre eux par un groupement de liaison pour une molécule d'intérêt 3-4. Biocapteurs pour bimoléculaires interactions protéine-protéine, par exemple, construit conçu pour surveiller la protéine G d'activation dans les cellules 5, tandis que les capteurs unimoléculaires meaSuring changements conformationnels sont largement utilisés pour des messagers de la seconde image tels que le calcium 6, AMPc 7-8, inositol phosphates 9 et cGMP 10-11. Ici, nous décrivons comment construire un épifluorescence personnalisée FRET système d'imagerie à partir de simples composants disponibles dans le commerce et la façon de contrôler l'ensemble de l'installation en utilisant le logiciel gratuit Micro-Manager. Cet instrument simple mais puissant est conçu pour des mesures de routine ou plus sophistiquées FRET dans des cellules vivantes. Les images acquises sont traitées à l'aide d'auto-écrite plug-ins de visualiser les changements dans les taux de FRET en temps réel au cours des expériences avant d'être stockées dans un format graphique compatible avec le build-in freeware ImageJ utilisé pour l'analyse ultérieure des données. Ce système à faible coût se caractérise par une grande flexibilité et peut être utilisé avec succès pour contrôler divers événements biochimiques et des molécules de signalisation par une pléthore de biocapteurs disponibles FRET dans des cellules vivantes et des tissus. A titre d'exemple, nous démontrons homment utiliser ce système d'imagerie pour effectuer un suivi en temps réel de l'AMPc dans des cellules vivantes 293A lors de la stimulation avec un agoniste des récepteurs β-adrénergiques et bloqueur.
Protocol
Discussion
dans ce protocole, nous montrons comment construire un système d'imagerie simple et peu coûteuse mais puissante FRET pour les applications de routine avec une variété de biocapteurs disponibles. Le système présenté ici est conçu pour les CFP et YFP ou des types similaires de protéines fluorescentes, comme la paire donneur-accepteur. Pendant ce temps, d'autres biocapteurs individuels sont disponibles qui utilisent par exemple vert et rouge protéines fluorescentes 14. Pour adapter le système …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Anke Rüttgeroth et Karina Zimmermann pour l'assistance technique. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (subvention NI 1301/1-1 à VON) et de l'Université de Göttingen Medical Center («pro futura" subvention à VON).
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
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