単分子バイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための顕微鏡のFRET
Summary
フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）顕微鏡は、レポーターとして、様々なバイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための強力な手法です。ここで我々はどのようにカスタマイズされたエピ蛍光を構築するには市販のコンポーネントと方法実験をFRETのためにそれを使用するからイメージングシステムをFRETについて説明します。
Abstract
フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）顕微鏡は、生きた細胞や組織の生化学およびシグナリングイベントをリアルタイムに監視するための技術として注目を獲得し続けています。古典的な生化学的方法に比べて、この新しい技術は、高い時間·空間分解能を特徴としている。実験が発現し 、in situ または in vivo 1-2 の時間をかけて撮影することができる様々な遺伝的にエンコードされたバイオセンサーを使用するFRET。典型的なバイオセンサーは、どちらかのタンパク質の蛍光団タグ付きペアまたはドナーおよび3-4目的の分子に対する結合部位と相互接続アクセプタフルオロフォアを庇護する単一のタンパク質の立体構造変化の間のFRET測定することにより、タンパク質-タンパク質相互作用を報告することができます。タンパク質-タンパク質相互作用のための二分子バイオセンサーとしては、例えば、単分子センサー測定しながら、セル5内のGタンパク質の活性化を監視するために設計され構築基準にするコンフォメーション変化は、広くカルシウムなど6のような画像のセカンドメッセンジャーであるcAMP 7-8、イノシトールリン酸9およびcGMP 10月11日に使用されます。ここでは、カスタマイズされたエピ蛍光を構築する方法について説明し、単一の市販コンポーネントとマイクロマネージャーのフリーウェアを使用して全体の設定を制御するためのイメージングシステムをFRET。このシンプルでありながら強力な楽器は生細胞中のFRETルーチンや、より洗練された測定用に設計されています。取得された画像は、グラフィック形式で格納される前に、任意の実験中にリアルタイムにFRET比の変化を可視化するために、自己記述されたプラグインを使用して処理されますとの互換性がビルド内の後続のデータ解析に使用ImageJのフリーウェア。この低コストのシステムは高い柔軟性を特徴とし、正常に使用できるの過多により、様々な生化学的イベントやシグナル伝達分子を監視するために使用することができることは生きた細胞や組織におけるバイオセンサーをFRET。例として、我々は時間を示していβ-アドレナリン受容体作動薬と拮抗薬による刺激時のLive 293A細胞内のcAMPのリアルタイム監視を実行するために、このイメージングシステムを使用するための流れ。
Protocol
Discussion
このプロトコルでは、我々は可能なバイオセンサーの様々なルーチンアプリケーション用のシンプルで低コストでありながら強力なFRETイメージングシステムを構築する方法を示します。ここで紹介するシステムは、ドナー – アクセプターペアとして、CFPとYFP、または蛍光タンパク質の類似したタイプのために設計されています。一方、他の個々のバイオセンサーは、例えば14を緑色?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、技術支援のためのアンケRüttgerothとカリーナジマーマンに感謝したいと思います。この作品は、ドイツ学術振興（VONに助成NI 1301/1-1）とゲッティンゲン大学医療センター（VONに "プロフューチュラ"グラント）によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
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