Dette papir detaljer hvordan du bruger kontinuerlig-flow hypoxi kamre til at skabe atmosfære med definerede koncentrationer af O<sub> 2</sub> At forstå biologiske reaktioner på nedsat O<sub> 2</sub>. Dette system er let at installere og vedligeholde, og fleksibel nok til at passe en bred vifte af O<sub> 2</sub> Koncentrationer og modelsystemer
Ilt er afgørende for alle metazoans at overleve, med en kendt undtagelse 1. Nedsat O 2 værelser (hypoxi) kan opstå under tilstande af sygdom, normal udvikling eller ændringer i de miljømæssige forhold 2-5. Forståelse af de cellulære signalveje, der er involveret i respons på hypoxi kan give ny indsigt i behandling strategier for forskellige humane patologier, fra slagtilfælde til kræft. Dette mål er blevet hæmmet i det mindste delvis af tekniske vanskeligheder i forbindelse med kontrolleret hypoksisk eksponering i genetisk modtagelige modelorganismer.
Nematoden Caenorhabditis elegans er velegnet som en model organisme til undersøgelse af hypoxisk reaktion, da det er let at dyrke og genetisk manipulation. Desuden er det muligt at studere cellulære reaktioner på specifikke hypoxiske O 2 koncentrationer uden forstyrrende virkninger, da C. elegans opnåelse O2 (og andre gasser) ved diffusion, i modsætning til et forenklet åndedrætsorganerne 6. Faktorer, der vides at være involveret i respons på hypoxi, er konserveret i C. elegans. Den faktiske respons på hypoxi afhænger af den specifikke koncentrationen af O2, der er til rådighed. I C. elegans, udsættelse for moderat hypoksi fremkalder en transkriptionel reaktion medieret høj grad af HIF-1, de stærkt konserverede hypoksi-inducerbar transkription faktor 6-9. c. elegans embryoer krav HIF-1 til at overleve i 5,000-20,000 ppm O2 7,10 . Hypoksi er en generel betegnelse for "mindre end normal O 2". Normoxi (normal O 2) kan også være svært at definere. Vi finder generelt rumluft, der er 210 tusind ppm O2 er normoxi. Imidlertid har det vist sig, at C. elegans har adfærdsmæssige præference for O 2-koncentrationer fra 5-12% (50,000-120,000 ppm O 2) 11. I larvae og voksne, HIF-1 handlinger for at forhindre hypoksi-induceret diapause i 5.000 ppm O 2 12. Imidlertid HIF-1 ikke spiller en rolle i reaktionen til lavere koncentrationer af O2 (anoxi, operationel definition <10 ppm O2) 13. I anoxi, C. elegans indgår en reversibel tilstand af suspenderet animation, hvor al mikroskopisk observerbare aktivitet ophører 10. Den kendsgerning, at forskellige fysiologiske reaktioner forekommer i forskellige forhold understreger vigtigheden af at have eksperimentel kontrol over den hypoxiske koncentrationen af O2.
Her præsenterer vi en metode til konstruktion og implementering af miljøkamre der producerer pålidelige og reproducerbare hypoxisk betingelser med veldefinerede koncentrationer af O 2. Den kontinuerlig metode sikrer hurtig ækvilibrering af kammeret og forøger stabiliteten af systemet. Derudover, gennemsigtighed ogtilgængelighed af kamrene muliggøre direkte visualisering af dyr blev udsat for hypoxi. Vi yderligere at demonstrere en effektiv metode til høst C. elegans prøver hurtigt efter udsættelse for hypoxi, hvilket er nødvendigt for at observere mange af de hurtigt-tilbageførte forandringer, der sker i hypoxi 10,14. Denne fremgangsmåde tilvejebringer en fundament, der let kan modificeres til individuelle laboratorie behov, herunder forskellige modelsystemer og forskellige gasser.
Denne fremgangsmåde giver en strategi til konstruktion af et hypoksisk miljø, der tillader miljøer med nøjagtige koncentrationer af oxygen, der skal holdes i laboratoriet. Disse kamre tilvejebringe en enkel fremgangsmåde til at udsætte organismer til specifikke lave koncentrationer af O2 og overvågning af molekylære og fysiologiske udgange. Den miljømæssige beskrevne kammer samles ved laboratoriet i stedet for kommercielt indkøbte og således kan modificeres til at passe til behovene for eksperimen…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmerne af Miller laboratoriet for diskussion og kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af en ny Investigator Award fra Nathan Shock Center of Excellence i Basic Biology of Aging til DLM og National Institutes of Health Prisen R00 AG030550 til DLM.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Tubing (FEP and PTFE) | Cole Parmer Tygon |
YO-95821-00 (1/8″ FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8″ PTFE)’ R-3603 |
Compression fittings | Seattle Fluid Systems | 06363-58 (M. coupler 1/16″) 06363-62 (F. coupler 1/16″) 06363-60 (M. coupler 1/8″) 06363-61 (F. coupler 1/8″) |
Flow tube | Aalborg | PMR3-010073 (3 output) PMR1-013520 (1 output) |
Mass flow controller | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) |
Compressed gas tank | AirGas | Made to order |
Plastic male Luer to hose barb fittings | Cole Parmer | 45505-41 (500 series 1/16″) |
Cast acrylic boxes | Ellard Instrumentation | Made to order |
Pipe fittings (Brass or stainless steel) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4″ nut) B-200-3 (1/8″ union tee) B-400-set (1/4″ ferrules) B-QM2-B1-200 (QM Body QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8″ male conn) |
Dow Corning Vacuum Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
AnaeroPack box | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0.4 liter) R685025 (2.5 liter) R685070 (7.0 liter) |
Pyrex gas wash bottle | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) |
Palmitic acid | Sigma-Aldrich | P0500 |
Goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase | Southern Biotechnology Associates | 1032-05 |
SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrate | Pierce Chemical | 34077 |
100 x 50 glass crystallization dishes | Kimax Kimble | 23000 |