突触荧光自动定量<em> C。线虫</em

Summary

强烈的大量聚集在突触的神经递质受体影响突触强度。这种方法量化单突触决议的荧光标记的神经递质受体在三个层面<em> C。线虫</em>，让数百个突触被迅速的特点是在一个单一的样本没有推出Z-平面上的投影的扭曲。

Abstract

突触的强度是指突触突触前神经递质释放的事件的反应幅度，并有一个整体的神经电路功能产生重大影响。突触强度严重依赖于大量聚集在突触的突触后膜部位的神经递质受体。受体水平的发展，建立和受体之间贩运表面本地化，突触，细胞内池代表突触可塑性和神经调节的重要机制，可以通过改变。严格的方法来量化本地化的突触神经递质受体的丰度是必不可少的，以研究突触的发展和可塑性。荧光显微镜是一个最佳的方法，因为它保留了空间信息，区分从非突触池的突触，和本地化为不同类型的突触受体人口之间的歧视。遗传模式生物线虫elegans是特别适合这些研究中，由于体积小，相对简单的神经系统，其透明度，并提供强大的基因技术，使本地完整的动物突触检查。

在这里，我们提出了一个定量荧光标记C.突触神经递质受体的方法线虫 。其主要特点是多面的共聚焦显微镜输出文件，制表位置，体积，荧光强度，并为每个突触的总荧光三个维度的单个突触的自动识别和分析。这种方法有两个超过手册z平面聚焦数据预测分析的主要优点。首先，因为每一个聚焦数据集平面，没有数据丢失通过Z-平面上的投影，通常是基于像素的强度平均值或最大值。其次，识别突触是自动化的，但可以通过前检查perimenter作为数据分析所得，允许快速，准确地从大量的突触中提取数据。数百数千突触每个样品可以很容易地获得，产生大量的数据集，以最大限度地提高统计能力。注意事项准备C。进行分析，并进行聚焦成像，以尽量减少动物在治疗组之间的变异线虫进行了讨论。尽管分析C。线虫突触后受体，这种方法通常是有用任何突触本地化的蛋白质，事实上，任何荧光信号，定位于离散集群，puncta，或细胞器的类型。

执行过程中的三个步骤：1）制备样品，2）聚焦成像，和3）图像分析。具体到 C步骤1和2 线虫 ，而第3步是普遍适用于任何点状共聚焦显微镜的荧光信号。

Protocol

1。成像蠕虫的制备这部分协议的基础上发表C.线虫培养技术1,2， 图1中概述。 生长在高的蛋白胨NGM的琼脂板（10厘米）播种与NA22 … E.蠕虫大肠杆菌的细菌，直到近饿死。染色，如果一个板块将可靠地生产出足够的蠕虫1个人污点，一路上，考虑损失和用于选择成像蠕虫（见第2部分）的严格标准。 DDH 2 0几毫升倾?…

Discussion

这里介绍的方法设计到突触的大量人口在 C中提取的多参数的定量数据线虫 ，同时最大限度地提高治疗组内的一致性。三个特点有助于实现这些目标。首先，免疫组化进行同步蠕虫种群，以确保所有的动物都是一样的年龄。这一步是至关重要的，因为发育调控的表达水平可能掩盖的实验性治疗的效果（如UNC的49 GABA受体免疫变化的若干倍在发展（光戴维斯等人，在准备中））。…

Materials

Name of the software	Company		Comments (optional)
Volocity v4.0 or higher	PerkinElmer/Improvision		Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity.
			Table 2. Specific reagents and equipment.
			Egg buffer NaCl KCl CaCl2 MgCl2 HEPES (Adjust pH to 7.3) 118 mM 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM Alkaline hypochlorite (for 5 ml) Fresh household bleach (discard bottle 30 days after opening) 10 N NaOH ddH2O 1.0 ml 0.25 ml 3.75 ml
			Table 1. Solutions.