आत्मीयता टैग पुनः संयोजक प्रोटीन के शोधन उच्च throughput

Summary

हम रीकॉम्बीनैंट तरल हैंडलिंग रोबोटिक्स का उपयोग प्रोटीन की आत्मीयता टैग शुद्धि के लिए एक विधि का वर्णन है. इस विधि आम तौर पर एक उच्च throughput प्रारूप में घुलनशील उनकी टैग प्रोटीन के छोटे पैमाने पर शोधन के लिए लागू है.

Abstract

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.

In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation – rather than to fluctuating experimental conditions – it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates^1-5.

Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex^6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase^9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the ‘abortive’ stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex^4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase⁴. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants – a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.

This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

Protocol

भाग एक: बैक्टीरियल संस्कृतियों के विकास के उच्च throughput. 1. जीवाणु ओवरनाइट Autoinduction मध्यम के 2 मिलीलीटर में 24-अच्छी तरह प्लेट का उपयोग कर आगे बढ़ें Microwaving द्वारा 24 अच्छी तरह प्लेटें Sterilise. हौसले से बड़े हो बैक्टीरियल कालोनियों या फ्रोजन ग्लिसरॉल स्टॉक के साथ autoinduction मध्यम (ओवरनाइट एक्सप्रेस मध्यम) के 1.5 मिलीलीटर टीका लगाना. हम आम तौर पर तीन व्यक्ति क्लोन कालोनियों के साथ उत्परिवर्ती प्रति तीन कुओं टीका लगाना. रिजर्व सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के लिए छह कुओं. सकारात्मक नियंत्रण के लिए हम बड़े होते हैं तीन wildtype क्लोन और नकारात्मक नियंत्रण के लिए हम जो एक गैर व्यक्त प्लाज्मिड के साथ बदल दिया गया है 2 क्लोनों बढ़ने. मध्यम केवल नियंत्रण के लिए एक अच्छी तरह से खाली छोड़ने से थाली की पर्याप्त नसबंदी के लिए जाँच करें. 37 में 18 घंटे के लिए कोशिकाओं को विकसित डिग्री सेल्सियस और 250 rpm पर मिलाते हुए. हम लाख-inducible (DE3) BL21 Rosetta 2 कोशिकाओं का उपयोग करें. Autoinduction मध्यम ग्लूकोज और लैक्टोज की एक मिश्रण होता है. शुरू में बैक्टीरियाग्लूकोज पर फ़ीड और फिर लैक्टोज, जो भी पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति लाती का उपयोग शुरू. ढक्कन हटाएँ और रोबोट मंच पर थाली जगह है. भाग ख: पुनः संयोजक प्रोटीन के रोबोट शुद्धिकरण. 2. रोबोट प्लेटफार्म तैयार धोने बफर 20 मिमी imidazole मिलकर, 0.1% ट्राइटन X-100, 0.5 एम NaCl, 20 मिमी Tris-एसीटेट, 7.9 पीएच, 10 मिमी 2 MgOAc, 0.7 मिमी 2 ZnOAc, 10% ग्लिसरॉल, और क्षालन बफर मिलकर 0.5 एम imidazole की, 0.1% ट्राइटन X-100, 0.5 एम NaCl, 20 मिमी Tris-एसीटेट, 7.9 पीएच, 10 मिमी 2 MgOAc, 0.7 मिमी ZnOAc 2, 10% ग्लिसरॉल. इन बफ़र्स को मोती धोने के बाद टैग प्रोटीन उन्हें करने के लिए बाध्य किया गया है, या मोती से प्रोटीन elute, क्रमशः के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. जीवाणु तनुकारक (वस्तु) (100 मिलीलीटर 15 μl antifoam अभिकर्मक के साथ आसुत जल). इस समाधान का इस्तेमाल किया जाएगाऑप्टिकल घनत्व (A600) मापन के लिए जीवाणु रातोंरात संस्कृतियों के dilutions. तनुकारक (वस्तु) में antifoam की उपस्थिति हवा के बुलबुले के गठन कि थाली पाठक माप के साथ हस्तक्षेप करेगा रोकता है. Lysis 10x FastBreak अभिकर्मक, 2 नमूना प्रति μl lysonase और 15 मिमी 2 MgOAc मिलकर समाधान करें. FastBreak डिटर्जेंट और नमक है कि बैक्टीरिया कोशिका की दीवारों को तोड़ने और intracellular प्रोटीन की रिहाई की सुविधा का एक मिश्रण होता है. Lysonase लाइसोजाइम और एक nuclease की एक मालिकाना मिश्रण है. Lysozyme कोशिका दीवार में खलल न डालें में सहायता और nuclease जारी बैक्टीरियल न्यूक्लिक एसिड हज़म. वैकल्पिक: एक 6 एम guanidine हाइड्रोक्लोराइड समाधान. कुछ पुनः संयोजक प्रोटीन Teflon लेपित pipetting सुइयों के लिए छड़ी करते हैं. guanidine हाइड्रोक्लोराइड समाधान प्रोटीन denatures और उन्हें बंद washes पानी है कि नियमित रूप से प्रत्येक सेंट के बाद धो सकते हैं रोबोट pipetting सुझावों कुल्ला करने के लिए इस्तेमाल किया और अधिक प्रभावी ढंगep. मिश्रण bicinchoninic एसिड (अभिकर्मक) समाधान और कॉपर सल्फेट समाधान (अभिकर्मक बी) द्वारा बीसीए (bicinchoninic एसिड) प्रोटीन quantitation अभिकर्मक तैयार: पेप्टाइड बांड + CuSO 4 बीसीए अभिकर्मक में मौजूद घटक से 1 घन 2 घन कम + जिससे 1 घन की राशि + पेप्टाइड समाधान में मौजूद बांड की संख्या के लिए आनुपातिक है. चरण में एक दूसरे, दो अणुओं bicinchoninic एसिड chelate 1 घन + 562 एनएम एक absorbance पाली में जिसके परिणामस्वरूप, एक बैंगनी रंग में जिसके परिणामस्वरूप. रंग प्रतिक्रिया समय पर निर्भर है और आम तौर पर कई घंटे की जरूरत के लिए निश्चित होना. उसके बाद रंग कई घंटे के लिए स्थिर है. सही आकार की troughs या प्लेटें भरें और रोबोट मंच पर उनके पूर्व आवंटित की स्थिति में उन्हें जगह. प्लेस guanidine हाइड्रोक्लोराइड बर्बाद करने के लिए एक 24-अच्छी तरह से थाली, दो 600 और ओवर ड्राफ्ट absorbance माप और एक नीले वीं के लिए 96-अच्छी तरह से थाली के लिए स्पष्ट 96 अच्छी तरह प्लेटेंई मंच पर अपने पदों पर शुट्ठ प्रोटीन. चुंबकीय स्टैंड पर एक प्लेट 96-deepwell रखें. MagneHis पतला नी कणों जो प्रोटीन बाँध बनाने के द्वारा अपने आसुत जल में 5 गुना और उन्हें मनका क्रियाशीलता इकाई में भरने उनकी टैग के साथ chelates. पर दोषी स्विच निलंबन में मोतियों रखने. रोबोट मंच पर स्विच और कई मिनट के लिए pipetting सुइयों फ्लश करने के लिए हवाई बुलबुले निकालें जो अन्यथा pipetting सटीकता के साथ हस्तक्षेप करेगा. फिर से प्रयोग करने योग्य pipetting सुइयों व्यक्तिगत pipetting कदम के बीच में निकाल रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, डिस्पोजेबल सुझावों को इस्तेमाल किया जा सकता है. बाद के सभी चरणों robotically किया जाता है. रोबोट प्रोटोकॉल अनुरोध पर उपलब्ध है. 3. सेल विकास OD600 मापने से जाँच की है रातोंरात संस्कृति का 10 μl तनुकारक (वस्तु) समाधान के 90 μl में पतला है. आयुध डिपो 600 उपाय करने के लिए यह सुनिश्चित करना है कि बैक्टीरिया को भी इसी तरह का घनत्व के हो गए हैं(1 चित्रा). 4. कोशिकाओं टूट रहे हैं प्रोटीन रिलीज करने की अनुमति दें मनका बाध्यकारी चुंबकीय नी मनका निलंबन के 100 μl 24-अच्छी तरह से एक दूसरे की थाली में से प्रत्येक में अच्छी तरह से वितरित किया जाता है. प्रत्येक छोटे पैमाने जीवाणु संस्कृति के 900 μl 24 ही मोती युक्त थाली में स्थानांतरित किया है. 10x मिश्रण / FastBreak lysonase के 100 μl जोड़ें. थाली 24-अच्छी तरह से कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए तेजी से मिलाते (800 आरपीएम) के लिए मिलाते हुए मंच के लिए स्थानांतरित किया है. बैक्टीरियल सेल दीवारों यांत्रिक बलों और रासायनिक क्रिया और recombinantly उत्पादित प्रोटीन समाधान में जारी किया जाता है का एक संयोजन द्वारा बाधित कर रहे हैं. उनके संबंध टैग के साथ वे तुरंत बाँध paramagnetic chelating निकल मोती. 5. मोती धो रहे हैं सेल lysates resuspended चुंबकीय मोतियों से युक्त एक प्लेट 96-deepwell जो मीटर के साथ एक स्टैंड पर तैनात है के लिए स्थानांतरित कर रहे हैंagnetic छड़ कि कुओं के बीच स्लाइड. 96 अच्छी तरह प्लेटें एक वर्ग नीचे शंकु के आकार का है जो तैरनेवाला के आसान हटाने की अनुमति देता है मिल गया है. कुओं तक की मात्रा 2.1 मिलीग्राम पकड़ रहे हैं, लेकिन बहुत छोटे संस्करणों के साथ भरा जा सकता है. यह हमें splashing द्वारा नमूना पार संदूषण के बिना जोरदार मिलाते हुए चरणों को पूरा करने में सक्षम बनाता है. विंदुक युक्तियाँ 6 एम guanidine – एचसीएल के साथ व्यक्तिगत pipetting कदम के बीच धो रहे हैं. TFIIB और अन्य "चिपचिपा" प्रोटीन की शुद्धि के लिए पार संक्रमण से बचने के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है. अन्य प्रोटीन के साथ यह सुई pipetting कदम के बीच पानी के साथ बड़े पैमाने पर कुल्ला करने के लिए पर्याप्त हो सकता है. चुंबकीय स्टैंड के चुंबकीय छड़ paramagnetic मोती को आकर्षित करने के लिए, उन्हें कुओं के केंद्र से दूर खींच और pipetting सुइयों तैरनेवाला के लिए स्वतंत्र पहुँच की अनुमति. तैरनेवाला खारिज कर दिया है. धोने बफर के 500 μl 1 प्लेट 24-अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा गया है और बाद में 96-अच्छी तरह से ई करने के लिए थाली को हस्तांतरितमोतियों की पूरी हस्तांतरण nsure. प्लेट 24-हिलनेवाला से अच्छी तरह से हटा दिया जाता है. धोने बफर के एक और 500 μl सीधे 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए जोड़ा है, थाली हिलनेवाला के लिए स्थानांतरित कर रहा है और तेजी से 1 मिनट के लिए हिल. थाली वापस चुंबकीय खड़ा करने के लिए ले जाया जाता है और धोने बफर त्याग. यह कदम दो बार दोहराया है और धोने प्रक्रिया थाली से कोई बफर अवशेष हटाने के द्वारा समाप्त हो गया है. 6. क्षालन बफर में प्रोटीन Elute क्षालन बफर के 100 μl मोती को जोड़ा जाता है, थाली हिलनेवाला के लिए ले जाया जाता है और तेजी से कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए हिल. प्लेट वापस शेखर और प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक करने के लिए ले जाया जाता है, शुद्ध रीकॉम्बीनैंट प्रोटीन युक्त, एक नई प्लेट को सौंप दिया है. 7. शुट्ठ प्रोटीन की सांद्रता के उपाय बीसीए अभिकर्मक मिश्रण की 190 μl एक स्पष्ट 96-अच्छी तरह से थाली को सौंप दिया है और समर्थक के 10 μltein समाधान जोड़ा. ऊष्मायन (5-6 आमतौर पर या रातोंरात) के कई घंटे के बाद, absorbance मापने और यह BSA मानकों करने के लिए की तुलना करने के लिए शुद्ध प्रोटीन तैयारियाँ (2 चित्रा) के प्रत्येक की सांद्रता का पता लगाने के लिए. शुट्ठ प्रोटीन अब उचित सांद्रता (3 चित्रा) में बहाव के अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 8. प्रतिनिधि परिणाम शुद्धि प्रोटोकॉल दो गुणवत्ता नियंत्रण चरणों, उदाहरण के दिखाया जाता है प्रदान करता है. हम शुट्ठ प्रोटीन (2 चित्रा) की पैदावार का आकलन करने पर संभावित समस्याओं की पहचान करने और दस्तावेज़ बैक्टीरियल विकास मंच (1 चित्रा) और बाद में करने में सक्षम हैं. हम आम तौर पर प्रोटीन शुद्ध और उन्हें तीन प्रतियों में परीक्षण. यह दो गुणवत्ता नियंत्रण के कदम के साथ संयोजन में, हमें विश्वास है कि हम किसी भी बदलाव हमारे कार्यात्मक assays में मनाया उत्परिवर्ती phenotyp के कारण कर रहे हैं देता है(3 चित्रा) ई और प्रयोगात्मक बदलाव या असफल Purifications की वजह से नहीं है. पैदावार 50-200 ग्राम से आम तौर पर सीमा प्राप्त की और विभिन्न कार्यात्मक assays के लिए पर्याप्त से अधिक हैं. चित्रा 1. एक 24 रातोंरात संस्कृतियों के साथ अच्छी तरह से थाली के आयुध डिपो माप के हिस्टोग्राम छह TFIIB उत्परिवर्ती वेरिएंट के रूप में के रूप में wildtype TFIIB की अच्छी तरह से तीन क्लोनों बड़ा हो गया है. दो मध्यम के साथ एक गैर व्यक्त प्लाज्मिड और एक अच्छी तरह से ले जाने क्लोनों केवल नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं. आयुध डिपो माप चलता है कि वहाँ अलग – अलग संस्कृतियों के बीच विकास दर में छोटे बदलाव कर रहे हैं. चित्रा 2. प्रोटीन इन संस्कृतियों से प्राप्त की पैदावार के रूप में एक बीसीए परख द्वारा निर्धारित और एसडीएस पृष्ठ द्वारा की पुष्टि. वेरिएंट के उच्च स्तर पर नहीं व्यक्त की है. कॉम मेंbination चित्रा 1 के साथ, हम यह निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि यह अंतर सेल के विकास के कारण नहीं था, लेकिन प्रोटीन अभिव्यक्ति की वजह से करने के लिए प्रेरित किया जा रहा है ठीक से नहीं. चित्रा 3. प्रतिनिधि एक प्रतिलेखन परख के परिणाम. हम RNAP के द्वारा छोटे निष्फल टेप के उत्पादन पर TFIIB वेरिएंट की उत्तेजना गतिविधि मापा. यहाँ, TFIIB K87 अवशेषों की एक एमिनो एसिड substitutions की एक पूरी लाइब्रेरी की उत्तेजना प्रभाव दिखाए जाते हैं. reproducibility के उच्च स्तर के छोटे त्रुटि दर के द्वारा पुष्टि की है. केवल एक नमूना दिखा तीन म्यूटेंट के प्रदर्शन के रूप में wildtype (wt), नकारात्मक (नेकां) नियंत्रण और क्षालन बफर की तुलना में जेल को नियंत्रित करता है नीचे दिखाया गया है.

Discussion

स्वचालित पुनः संयोजक प्रोटीन शोधन विधि यहाँ वर्णित उत्परिवर्ती प्रोटीन की एक बड़ी संख्या के उत्पादन और शोधन के एक छोटे पैमाने पर प्रारूप में न्यूनतम मानवीय हस्तक्षेप के साथ अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने की शर्तों के तहत आंकड़े 1 और 2 व्यवस्थित गुणवत्ता नियंत्रण और के उदाहरण के शो के परिणाम की अनुमति देता है. शुट्ठ प्रोटीन चित्रा 3 से पता चलता है कि शुद्ध प्रतिलेखन कारकों इस उदाहरण में प्रयुक्त कार्यात्मक assays में एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके में प्रदर्शन.

हालांकि प्रक्रिया archaeal TFIIB की शुद्धि के लिए विकसित किया गया था, यह आत्मीयता टैग प्रोटीन की शुद्धि के लिए व्यापक रूप से लागू होता है. ऐसे स्वचालित शोधन प्रोटोकॉल का उपयोग इस प्रकार पुनः संयोजक प्रोटीन की जैव रासायनिक विश्लेषण काफी सुविधा होगी और इस तरह से है कि मैन्युअल रूप से प्राप्त करने के लिए मुश्किल है पैमाने पर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की हमारी समझ को आगे जाएगा.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Overnight Express Instant TB Medium	Merck Chemicals Ltd	71491-4
FastBreak	Promega Ltd.	V8573
Lysonase Bioprocessing Reagent/ 1 ml	Merck Chemicals Ltd	71230
Antifoam 204	Sigma-Aldrich Company Ltd	A6426
MagneHis Ni-Particles	Promega	V8565
Imidazole	Sigma-Aldrich Company Ltd	56750
Trizma base	Sigma-Aldrich Company Ltd.	93362
NaCl	VWR	27810.295
Bicinchoninic Acid protein determination	Sigma-Aldrich Company Ltd	BCA1-1KT
Deep Well Plate 2.2 ml Square Wells PP pk10	Anachem Ltd	1810-00
Microplate MicroWell 96 well flat bottom polystyrene not treated 12 sleeves of 5 plates clear 0.4 ml well volume 128 mm x 86 mm Thermo Scientific Nunc	Fisher Scientific Ltd.	DIS-984-090M
Microplate Blue	VWR	NUNC367001
24-Well Blocks RB (24)	Qiagen	19583
Guanidine hydrochloride	VWR	ALFAA13543.0B
Washable needle for TheOnyx	Aviso GmbH	8152-317001
Reagent Rack for Magnetic Beads	Aviso GmbH	8152-035003
Plate Reader Synergy HT	BioTek	4200-000043
Robotic Platform TheOnyx 44OH/150/100	Aviso GmbH	8145-050046
Microplate Shaker Variomag Teleshaker	Inheco	3800047
96-well Magnet Type A	Qiagen	36915