Vi beskriver ett förfarande för affinitets-märkta rening av rekombinanta proteiner med användning av vätske-hantering robotteknik. Denna metod är allmänt tillämpbar på den småskaliga rening av lösliga His-märkta proteiner i en hög genomströmning formatet.
Röntgenkristallografi är den metod som föredras för att erhålla en detaljerad vy av strukturen av proteiner. Sådana studier måste kompletteras med ytterligare biokemiska analyser för att få detaljerade insikter i struktur / funktion relationer. Framsteg inom oligonukleotid-och gensyntes teknik göra stora mutagenes strategier alltmer möjligt, inklusive substitution av målrester av alla 19 andra aminosyror. Vinst-eller förlust-av-funktion fenotyper kan sedan systematiskt slutsatser, såsom bidrag särskilda rester till katalytisk aktivitet, protein stabilitet och / eller protein-proteininteraktion specificitet.
För att tillskriva de olika fenotyper till naturen av mutationen – snarare än till en fluktuerande experimentella förhållanden – det är viktigt att rena och analysera proteinerna på ett kontrollerat och reproducerbart sätt. Hög kapacitet strategier och automatisering av manuella protokoll omrobotic flytande hantering plattformar har skapat möjligheter att utföra sådana komplexa molekylärbiologiska förfaranden med lite mänsklig inblandning och minimal felprocent 1-5.
Här presenterar vi en generell metod för rening av His-märkta rekombinanta proteiner i en hög genomströmning sätt. I en nyligen genomförd studie, tillämpade vi denna metod till en detaljerad struktur-funktion undersökning av TFIIB, en komponent i basala transkriptionsmaskineriet. TFIIB är oumbärligt för promotor riktad transkription in vitro och är en förutsättning för rekrytering av RNA-polymeras i en preinitiation komplex 6-8. TFIIB innehåller en flexibel linker-domän som penetrerar det aktiva stället klyftan av RNA-polymeras 9-11. Denna linkerdomänen ger två biokemiskt kvantifierbara aktiviteter på TFIIB, nämligen (i) stimulering av den katalytiska aktiviteten under "misslyckade" stadium avskrift initiering, och (ii) en kompletterande bidrag tillspecifik rekrytering av RNA-polymeras i preinitiation komplexa 4,5,12. Vi utnyttjade hög genomströmning reningsmetod för att generera enkel-, dubbel och trippel substitution och strykningar mutationer inom TFIIB länkaren och därefter analysera dem i funktionella analyser för deras stimulerande effekt på den katalytiska aktiviteten av RNA-polymeras 4. Sammantaget, vi genererade, renas och analyseras 381 mutanter – en uppgift som skulle ha varit tidskrävande och arbetsamt att utföra manuellt. Vi producerade och analyserade proteiner i multiplicates som tillät oss att uppskatta eventuella experimentella variationer och gav oss en klar uppfattning om reproducerbarheten av våra resultat.
Denna metod fungerar som en generisk protokoll för rening av His-inmärkta proteiner och har med framgång använts för att rena andra rekombinanta proteiner. Det är för närvarande optimerad för rening av 24 proteiner, men kan anpassas för att rena upp till 96 proteiner.
Den automatiserade rekombinanta proteinet reningsmetod beskrivs här möjliggör produktion och rening av ett stort antal muterade proteiner i en småskalig formatet under starkt reproducerbara förhållanden med minimal mänsklig inblandning. Figurerna 1 och 2 visar resultaten av systematiska kvalitets-kontroller och exempel på renade proteiner. Figur 3 visar att de renade transkriptionsfaktorer som användes i detta exempel göra på ett mycket reproducerbart sätt i funktionella analyser.
Även om förfarandet var utvecklad för rening av archaeal TFIIB är det allmänt tillämpas för rening av affinitet-märkta proteiner. Användningen av sådana automatiserade reningsprotokoll kommer således avsevärt underlätta biokemisk analys av rekombinanta proteiner och därmed öka vår förståelse av protein-proteininteraktioner i en skala som är svårt att uppnå manuellt.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av en Wellcome projektbidrag (078043/Z/05/Z) till ROJW
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Overnight Express Instant TB Medium | Merck Chemicals Ltd | 71491-4 | |
FastBreak | Promega Ltd. | V8573 | |
Lysonase Bioprocessing Reagent/ 1 ml | Merck Chemicals Ltd | 71230 | |
Antifoam 204 | Sigma-Aldrich Company Ltd | A6426 | |
MagneHis Ni-Particles | Promega | V8565 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich Company Ltd | 56750 | |
Trizma base | Sigma-Aldrich Company Ltd. | 93362 | |
NaCl | VWR | 27810.295 | |
Bicinchoninic Acid protein determination | Sigma-Aldrich Company Ltd | BCA1-1KT | |
Deep Well Plate 2.2 ml Square Wells PP pk10 | Anachem Ltd | 1810-00 | |
Microplate MicroWell 96 well flat bottom polystyrene not treated 12 sleeves of 5 plates clear 0.4 ml well volume 128 mm x 86 mm Thermo Scientific Nunc | Fisher Scientific Ltd. | DIS-984-090M | |
Microplate Blue | VWR | NUNC367001 | |
24-Well Blocks RB (24) | Qiagen | 19583 | |
Guanidine hydrochloride | VWR | ALFAA13543.0B | |
Washable needle for TheOnyx | Aviso GmbH | 8152-317001 | |
Reagent Rack for Magnetic Beads | Aviso GmbH | 8152-035003 | |
Plate Reader Synergy HT | BioTek | 4200-000043 | |
Robotic Platform TheOnyx 44OH/150/100 | Aviso GmbH | 8145-050046 | |
Microplate Shaker Variomag Teleshaker | Inheco | 3800047 | |
96-well Magnet Type A | Qiagen | 36915 |