Sıralama Kök Hücre Tahliller ve Akış Primer Beyin Tümörü Doku İşleme
Summary
Beyin tümörü başlatan hücreler (BTICs), heterojen bir tümör sahip kök hücre özellikleri içinde nadir hücrelerinin tanımlanması insan beyin tümörü patogenezinde sağlayan yeni anlayışlar içine. Biz BTICs için zenginleştirmek özgü kültür koşullarının rafine var ve biz rutin daha bu popülasyonların zenginleştirmek için flow sitometri kullanın. Tek hücre RT-PCR ile kendini yenileme analizleri ve transkript analiz sonra bu izole hücreler üzerinde de yapılabilir.
Abstract
Beyin tümörlerinin tipik olarak sinir soy belirteçler, çeşitli ifade morfolojik olarak farklı hücre oluşmaktadır. Stem hücre özellikleri ile tümör hücrelerinin sadece nispeten küçük bir kısmı olarak adlandırıldı, beyin tümörü başlatıcı hücreleri (BTICs), çoklu soyların birlikte ayırmak kendini yenilemek ve in vivo olarak tümör başlatmak için bir yeteneğine sahiptirler. Biz aslında insan beyninin çeşitli tümörlerde normal nöral kök hücreler (NSC'lerde) için kullanılır ve bu kültürü yöntemi özellikle kök benzeri popülasyonları için seçtiği bulundu kültür koşulları uygulanır. Serum serbest orta (MGK) bir farklılaşmamış kök hücre devletin bakım için izin verir, ve bFGF ve EGF ilave çoklu güçlü, kendini sürekli yenileyen yayılması ve genişletilebilir tumorspheres sağlar.
İlave her tümörün BTIC nüfusu karakterize etmek için, flow sitometri ile hücre yüzey belirteçleri değerlendirmek. Biz de daha spesifik karakterize ilgi popülasyonları sıralayabilirsiniztirme. Kendini yenileme deneyleri 96 kuyucuğu ayrılır tek BTICs gerçekleştirilir; 37 inkübasyon sonrasında tumorspheres oluşumu ° C kök veya progenitör hücre varlığını gösterir. Belirli bir nüfus Çoklu hücre sayıları, aynı zamanda kendini yenileme kapasitesini analiz etmek için, seyreltme analizi sınırlandırılması için farklı kuyularda sıralanabilir. Biz de tek hücre RT-PCR kullanarak belirli bir hücre popülasyonu içindeki diferansiyel gen ekspresyonu çalışabiliriz.
Aşağıdaki protokoller BTIC popülasyonları gibi tumorspheres ayrışma için zenginleştirmek için primer insan örnekleri ayrışma ve kültürleme için işlemler açıklanmaktadır. Ayrıca akım sitometri analizi veya sıralama, kendini yenileme deneyleri ve tek hücreli RT-PCR için boyama için protokoller dahildir.
Introduction
Beyin tümörleri insanlarda bilinen en agresif ve heterojen kanserler arasındadır. Onların erken tespiti ve teşhisi, modern nöro-görüntüleme teknolojisi tarafından kolaylaştırılmış olmasına rağmen, biz yine de özellikle diffüz, invaziv olanları veya beyinde derin yerleşimli olanlar için, birçok beyin tümörleri için tedavi edici tedaviler yoksundur.
Beyin tümörleri çok agresif ve çoğu zaman çaresiz doğası nedeniyle çocuklarda kanser ölümlerinin önde gelen nedenlerindendir. Glioblastoma (GBM), erişkinlerde en sık rastlanan primer beyin tümörü olan eşit ölümcül prognozu 1 için korkulan en saldırgan insan kanserleri, biridir. Bu son derece malign astrositik tümör (WHO grade 4) genellikle yetişkinlerin hemisferlerin oluşur ve aynı zamanda küçük çocuklar ve bebeklerde oluşabilir. Onun büyüme hızlı ve infiltratif ve tanı patolojik özellikleri, nükleer pleomorfizm, mikrovasküler proliferasyon ve nekroz 2,3 bulunmaktadır. Adul içints yeni teşhis GBM birlikte ortanca sağkalım nadiren tüm tedavilerin genellikle yoksul cevapları, 12 ay 1 ötesine uzanır. Biz somatik kök hücre ve kanser hücreleri tarafından paylaşılan birçok fonksiyonel ve genetik benzerlikler bulunmaktadır kaydetti ve normal beyin gelişimini düzenleyen moleküler yollar genellikle kanser düzensiz olduğunu. Beyin tümörlerinin çalışma kök hücre biyolojisi paradigmalar uygularken, biz prospektif belirlemek ve proliferasyon, kendini yenileme kök hücre özelliklerini sergiledi insan GBMs bir hücre subpopülasyonu arındırmak için ilk araştırmacılardan olan, ve in vitro 4 ve farklılaşma İn vivo 5. Biz aslında çok pediatrik ve yetişkin beyin tümörleri için in vitro 6,7 normal nöral kök hücreler (NSC'lerde) karakterize etmek için kullanılan kültür koşulları ve testleri uygulanır ve CD133 8 nöral progenitör hücre yüzey işaretleyici için sıralama hücre tarafından bu kök-benzeri hücreler için zenginleştirilmiş ,9. CD133 + beyin tümörü fraksiyonu NOD-SCID fare beyinlerinde 5,10 CD133-fraksiyonu daha tümör gelişimini çok daha yüksek frekanslı vardı hücrelerini içeriyordu. Bu resmen kök hücre özellikleri ile beyin tümör hücrelerinin sadece nadir alt, tümör-başlatıcı adı "beyin tümör hücrelerinin başlatılması" onlara kazanç veya "BTICs" olduklarını belirlediler. BTICs ve roman tanımlama birçok solid tümör için temel olarak kanser kök hücre hipotezi 10-13 için güçlü bir destek vererek, insan beyninin tümörogenez sağlayan yeni anlayışlar içine, ve daha etkin kanser tedavilerinin 14-20 için yeni bir hücresel hedef kurar. Tümör toplu öldürme odaklı tümör büyümeye devam sağlayan nadir kök benzeri fraksiyonu kaçırabileceği Tedaviler. Kanser kök hücre öldürme odaklanan beyin tümörleri olan hastalar için daha iyi tedavi ve prognoz verebileceğini Tedaviler.
BTIC nüfus incelemek için, bizim cultu rafine varÖzellikle kök hücre özelliklerine sahip İnsan beyin tümörleri içinde hücre popülasyonları için seçmek için protokolleri yeniden. Serum serbest, nöral kök orta bir farklılaşmamış kök hücre devletin bakım sağlar, hücre (MGK) ve temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), epidermal büyüme faktörü (EGF) ve lösemi inhibitör faktör ilavesi (LIF) sağlar çok güçlü, kendini sürekli yenileyen ve genişletilebilir insan tumorspheres yayılması. Burada, birincil beyin tümörleri ve BTIC popülasyonlar için zenginleştirmek MGK orta kültür onları işlemeye dahil yöntemleri açıklanmaktadır. Bizim deneysel model sistemi bu hücreleri sadece minimal kök altında kültüre gerçeğini vurgulamak için "BTIC hasta izolatları" çağrısında bulundular kök hücre popülasyonlarının için seçmek için hücre koşulları. gibi CD133 ve CD15 ve akım sitometri analizi gibi temel kök hücre belirteçleri için BTIC popülasyonlarının sonraki immunolabelling de açıklanmıştır. Biz o zaman sınırlayıcı seyreltme analizini tartışır,Hangi BTICs ve kendini yenileme potansiyeli okuyan yardımcı olur. Nihayet, biz AmpliGrid Slaytlarınıza tek hücre sıralama ve tek hücre RT-PCR yaparak bu nadir hücrelerin gen ekspresyon analizi keşfedebilirsiniz. Bu teknikler ayrıca bu tür medulloblastom, ependimoma, pediatrik gliomları gibi diğer beyin tümörleri için de geçerlidir.
Protocol
Discussion
Lösemi 21 çalışmasına dayalı kanser kök hücresi hipotezine 10, meme kanseri 11 ve beyin kanseri 4,5, tümör hücrelerinin yalnızca görece küçük bir kısmını adlandırılan kanser kök hücreleri, yoğun çoğalmaya başlar ve kendini bir yeteneğe sahip olduğunu göstermektedir -yenilemek. Tümör hücrelerinin çoğu prolifere ve tümörün fenotipik imzası haline hücrelere farklılaşırlar olarak kendini yenileme yeteneğini kaybeder. Tümör muhafaza ede…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Kanser Araştırma Ontario Enstitüsü (OICR), Terry Fox Vakfı ve Nörolojik Cerrahlar Amerikan Derneği tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 1:1 DMEM:F12 | Invitrogen | 11320-082 |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 |
| 1M HEPES | Wisent | 330-050-EL |
| Glucose | Invitrogen | 15023-021 |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165-25g |
| Neural survival factor -1 (NSF-1) | Lonza Clonetics | CC-4323 |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0261 |
| Leukemia inhibitory factor (LIF) | Millipore | LIF1010 |
| Antibiotic/mycotic | Wisent | 450-115-EL |
| Liberase TM | Roche | 05 401 119 001 |
| Ammonium chloride solution | Stem Cell Technologies | 07850 |
References
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Epidemiology and etiology of gliomas. Acta Neuropathol. 109, 93 (2005).
- Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma. 10, 319 (2010).
- Wechsler-Reya, R., Scott, M. P. The developmental biology of brain tumors. Annu. Rev. Neurosci. 24, 385 (2001).
- Singh, S. K. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821 (2003).
- Singh, S. K. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396 (2004).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1 (1996).
- Tropepe, V. Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev. Biol. 208, 166 (1999).
- Yin, A. H. AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 90, 5002 (1997).
- Yu, Y., Flint, A., Dvorin, E. L., Bischoff, J. AC133-2, a novel isoform of human AC133 stem cell antigen. J. Biol. Chem. 277, 20711 (2002).
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
- Al-Hajj, M. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 3983 (2003).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 3, 730 (1997).
- Matsui, W. Characterization of clonogenic multiple myeloma cells. Blood. 103, 2332 (2004).
- Bao, S. Targeting cancer stem cells through L1CAM suppresses glioma growth. Cancer Res. 68, 6043 (2008).
- Bao, S. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756 (2006).
- Bao, S. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843 (2006).
- Beier, D. Temozolomide preferentially depletes cancer stem cells in glioblastoma. Cancer Res. 68, 5706 (2008).
- Piccirillo, S. G. Distinct pools of cancer stem-like cells coexist within human glioblastomas and display different tumorigenicity and independent genomic evolution. Oncogene. 28, 1807 (2009).
- Piccirillo, S. G. morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444, 761 (2006).
- Rich, J. N., Bao, S. Chemotherapy and cancer stem cells. Cell Stem Cell. 1, 353 (2007).
- Lapidot, T. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645 (1994).
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
- Fuchs, E., Segre, J. A. Stem cells: a new lease on life. Cell. 100, 143 (2000).
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157 (2000).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707 (1992).
- Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, 4565 (1992).
- Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science. 166, 747 (1969).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495 (1975).
- Barrett, L. E. Self-renewal does not predict tumor growth potential in mouse models of high-grade glioma. Cancer Cell. 21, 11 (2012).
- Venugopal, C. Bmi1 marks intermediate precursors during differentiation of human brain tumor initiating cells. Stem Cell Res. 8, 141 (2012).
- Gerlinger, M. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883 (2012).
- Gilbertson, R. J. Medulloblastoma: signalling a change in treatment. Lancet. Oncol. 5, 209 (2004).
- Zhu, Y., Parada, L. F. The molecular and genetic basis of neurological tumours. Nat. Rev. Cancer. 2, 616 (2002).
- Maher, E. A. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15, 1311 (2001).
- Blake, W. J., KAErn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633 (2003).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183 (2002).
- Maheshri, N., O’Shea, E. K. Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 413 (2007).
- Raj, A. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4, e309 (2006).
- Ross, I. L., Browne, C. M., Hume, D. A. Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently. Immunol. Cell Biol. 72, 177 (1994).
- Kubista, M. The real-time polymerase chain reaction. Mol. Aspects Med. 27, 95 (2006).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1, 1559 (2006).
