Verwerking van primaire hersentumor Weefsel voor Stem Cell Testen en Flow sorteren
Summary
De identificatie van hersentumor initiëren cellen (BTICs), de zeldzame cellen binnen een heterogene tumor bezit stamcel eigenschappen, geeft nieuwe inzichten in de menselijke hersenen tumor pathogenese. We hebben verfijnd specifieke kweekomstandigheden te verrijken voor BTICs, en we routinematig gebruik van flowcytometrie om verder te verrijken deze populaties. Zelfvernieuwing en assays transcript analyse door eencellige RT-PCR kan vervolgens worden uitgevoerd op deze geïsoleerde cellen.
Abstract
Hersentumoren bestaan typisch uit diverse cellen die morfologisch verschillende neurale lineage markers drukken. Slechts een relatief klein deel van de cellen in de tumor met stamcel eigenschappen genoemd hersentumor inleiding cellen (BTICs) bezitten het vermogen om te differentiëren langs diverse lineages, zichzelf te vernieuwen en initiëren tumoren in vivo. We pasten kweekomstandigheden oorspronkelijk gebruikt voor normale neurale stamcellen (NSC's) om een verscheidenheid van humane hersentumoren en dat deze cultuur methode die specifiek kiest voor steelachtige populaties. Serumvrij medium (NSC) zorgt voor de instandhouding van een ongedifferentieerde stamcel staat, en de toevoeging van bFGF en EGF maakt de verspreiding van multi-potente, zelfvernieuwende en uitbreidbaar tumorspheres.
Verder te karakteriseren elke tumor BTIC bevolking evalueren we celoppervlaktemarkers door flowcytometrie. We kunnen ook sorteren populaties van belang zijn voor meer specifieke characterizatie. Zelfvernieuwing assays worden uitgevoerd op enkele BTICs gerangschikt in platen met 96 putjes, de vorming van tumorspheres na incubatie bij 37 ° C geeft de aanwezigheid van een stengel of progenitor cel. Meerdere mobiele nummers van een bepaalde populatie kunnen ook worden gesorteerd in verschillende putten voor het beperken van verdunning analyse, tot zelfvernieuwing capaciteit te analyseren. We kunnen differentiële genexpressie ook bestudeerd in een bepaalde celpopulatie met enkele cel RT-PCR.
De volgende protocollen beschreven onze procedures voor de dissociatie en kweek van primaire humane monsters verrijken BTIC populaties en de dissociatie van tumorspheres. Ook zijn protocollen voor kleuring voor flowcytometrie analyse of sorteren, zelfvernieuwing assays en cel RT-PCR.
Introduction
Hersentumoren behoren tot de meest agressieve en heterogene kanker bekend bij mensen. Hoewel hun vroegere opsporing en diagnose zijn vergemakkelijkt door moderne neuro-imaging-technologie, hebben we nog steeds geen curatieve therapieën voor vele hersentumoren, met name voor diffuse, invasieve die of die diep in de hersenen.
Hersentumoren vormen de belangrijkste oorzaak van kankersterfte bij kinderen als gevolg van hun zeer agressieve en vaak ongeneeslijke aard. Glioblastoma (GBM), de meest voorkomende primaire hersentumor bij volwassenen, is een van de meest agressieve humane kankers, gevreesd voor het gelijkmatig fatale prognose 1. Deze zeer kwaadaardige tumor astrocytaire (WHO-graad 4) treedt meestal op in de cerebrale hemisferen van volwassenen, en kan ook voorkomen bij jonge kinderen en zuigelingen. De groei is snel en infiltratieve, en diagnostische pathologische kenmerken zijn nucleaire pleomorfisme, microvasculaire proliferatie en necrose 2,3. Voor Adults met nieuw gediagnosticeerde glioblastoma, mediane overleving verlengt zelden langer dan 12 maanden 1, met over het algemeen een slechte antwoorden op alle therapeutische modaliteiten. Wij stelden vast dat er vele functionele en genetische overeenkomsten gedeeld door somatische stamcellen en kankercellen en de moleculaire mechanismen die de normale ontwikkeling van de hersenen reguleren vaak ontregelde in kanker. Bij de toepassing stamcelbiologie paradigma voor de studie van hersentumoren waren we de eersten die prospectief identificeren en zuiveren een subpopulatie van cellen uit humane GBMS die stamcellen eigenschappen van proliferatie, zelfvernieuwing optrad en differentiatie in vitro 4 en vivo 5. We toegepaste kweekomstandigheden en assays oorspronkelijk normale neurale stamcellen (NSC's) te karakteriseren in vitro 6,7 meerdere pediatrische en volwassen hersentumoren en verrijkt voor deze stam-achtige cellen door celsortering de neurale voorlopercellen celoppervlaktemarker CD133 8 ,9. De CD133 + hersentumor fractie bevatte cellen die een veel hogere frequentie van tumorinitiatie hadden dan de CD133-fractie in NOD-SCID muizenhersenen 5,10. Dit formeel vastgelegd dat alleen een zeldzame subset van hersentumor cellen met stamcellen eigenschappen zijn tumor-initiërende, verdienen ze de naam "hersentumor initiëren cellen" of "BTICs". De nieuwe identificatie van BTICs geeft nieuwe inzichten in de menselijke hersenen ontstaan van tumoren, waardoor sterke steun voor de kankerstamcel hypothese 10 tot 13 als basis voor vele solide tumoren, en stelt een nieuwe cellulaire doel voor een meer doeltreffende kankertherapieën 14-20. Therapieën gericht op het doden van de bulk van de tumor kan de zeldzame steelachtige fractie missen, waardoor de tumor blijft groeien. Therapieën die zich richten op het doden van de kankerstamcel kan een betere behandeling en de prognose voor patiënten met hersentumoren te bieden.
Met het oog op BTIC populaties te bestuderen, hebben we verfijnd onze cultuopnieuw protocollen om specifiek te kiezen voor celpopulaties binnen de menselijke hersentumoren die stamcellen eigenschappen bezitten. Serumvrij, neurale stamcellen (NSC) medium maakt het onderhoud van een ongedifferentieerde stamcel toestand, en de toevoeging van basic fibroblast growth factor (bFGF), epidermale groeifactor (EGF), en leukemie inhiberende factor (LIF) maakt de proliferatie van multi-potente, zelfvernieuwende, en uitbreidbaar menselijke tumorspheres. Hier beschrijven we de methoden van verwerking van primaire hersentumoren en kweken ze in NSC medium te verrijken voor BTIC populaties. We noemen ons experimenteel modelsysteem "BTIC patiënt isolaten" het feit dat deze cellen slechts minimaal stam gekweekt onder benadrukken celomstandigheden te selecteren op stamcelpopulaties. latere immunolabelling van BTIC populaties voor belangrijke stamcel markers zoals CD15 en CD133 en flowcytometrie analyse wordt ook beschreven. Vervolgens bespreken we de beperkende verdunning analyse,die helpt bij het bestuderen van de zelfvernieuwing potentieel van BTICs. Tot slot onderzoeken we de genexpressie analyse van deze zeldzame cellen door het sorteren enkele cellen op AmpliGrid dia's en het uitvoeren van enkele cel RT-PCR. Deze technieken zijn ook toepasbaar op andere hersentumoren zoals medulloblastoom, ependymoom en pediatrische gliomen.
Protocol
Discussion
De kankerstamcel hypothese 10, op basis werk leukemie 21, borstkanker 11 en hersenkanker 4,5, blijkt dat slechts een relatief klein deel van de cellen in de tumor, kanker stamcellen genoemd, het vermogen om uitgebreid prolifereren en zelf bezitten -vernieuwen. De meeste tumorcellen verliezen het vermogen om te prolifereren en zichzelf te vernieuwen als te differentiëren in cellen die de fenotypische handtekening van de tumor. Het vinden van de sleutel cellen in de hersenen tu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Ontario Institute of Cancer Research (OICR), de Terry Fox Foundation en de American Association of Neurological Surgeons.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 1:1 DMEM:F12 | Invitrogen | 11320-082 |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 |
| 1M HEPES | Wisent | 330-050-EL |
| Glucose | Invitrogen | 15023-021 |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165-25g |
| Neural survival factor -1 (NSF-1) | Lonza Clonetics | CC-4323 |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0261 |
| Leukemia inhibitory factor (LIF) | Millipore | LIF1010 |
| Antibiotic/mycotic | Wisent | 450-115-EL |
| Liberase TM | Roche | 05 401 119 001 |
| Ammonium chloride solution | Stem Cell Technologies | 07850 |
References
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Epidemiology and etiology of gliomas. Acta Neuropathol. 109, 93 (2005).
- Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma. 10, 319 (2010).
- Wechsler-Reya, R., Scott, M. P. The developmental biology of brain tumors. Annu. Rev. Neurosci. 24, 385 (2001).
- Singh, S. K. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 63, 5821 (2003).
- Singh, S. K. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396 (2004).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1 (1996).
- Tropepe, V. Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev. Biol. 208, 166 (1999).
- Yin, A. H. AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 90, 5002 (1997).
- Yu, Y., Flint, A., Dvorin, E. L., Bischoff, J. AC133-2, a novel isoform of human AC133 stem cell antigen. J. Biol. Chem. 277, 20711 (2002).
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
- Al-Hajj, M. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 3983 (2003).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 3, 730 (1997).
- Matsui, W. Characterization of clonogenic multiple myeloma cells. Blood. 103, 2332 (2004).
- Bao, S. Targeting cancer stem cells through L1CAM suppresses glioma growth. Cancer Res. 68, 6043 (2008).
- Bao, S. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, 756 (2006).
- Bao, S. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843 (2006).
- Beier, D. Temozolomide preferentially depletes cancer stem cells in glioblastoma. Cancer Res. 68, 5706 (2008).
- Piccirillo, S. G. Distinct pools of cancer stem-like cells coexist within human glioblastomas and display different tumorigenicity and independent genomic evolution. Oncogene. 28, 1807 (2009).
- Piccirillo, S. G. morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444, 761 (2006).
- Rich, J. N., Bao, S. Chemotherapy and cancer stem cells. Cell Stem Cell. 1, 353 (2007).
- Lapidot, T. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645 (1994).
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414, 105 (2001).
- Fuchs, E., Segre, J. A. Stem cells: a new lease on life. Cell. 100, 143 (2000).
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157 (2000).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707 (1992).
- Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, 4565 (1992).
- Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science. 166, 747 (1969).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495 (1975).
- Barrett, L. E. Self-renewal does not predict tumor growth potential in mouse models of high-grade glioma. Cancer Cell. 21, 11 (2012).
- Venugopal, C. Bmi1 marks intermediate precursors during differentiation of human brain tumor initiating cells. Stem Cell Res. 8, 141 (2012).
- Gerlinger, M. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883 (2012).
- Gilbertson, R. J. Medulloblastoma: signalling a change in treatment. Lancet. Oncol. 5, 209 (2004).
- Zhu, Y., Parada, L. F. The molecular and genetic basis of neurological tumours. Nat. Rev. Cancer. 2, 616 (2002).
- Maher, E. A. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15, 1311 (2001).
- Blake, W. J., KAErn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633 (2003).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183 (2002).
- Maheshri, N., O’Shea, E. K. Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 413 (2007).
- Raj, A. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4, e309 (2006).
- Ross, I. L., Browne, C. M., Hume, D. A. Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently. Immunol. Cell Biol. 72, 177 (1994).
- Kubista, M. The real-time polymerase chain reaction. Mol. Aspects Med. 27, 95 (2006).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1, 1559 (2006).
