Den effektive fastfase-peptidsyntese af en funktionaliseret bis-peptid trimer anvendelse af en "sikkerheds"-spaltning proceduren fra HMBA harpiks er beskrevet.
I 1962, publiceret RB Merrifield den første procedure under anvendelse af fast-fase peptidsyntese som en hidtil ukendt vej til effektivt syntetisere peptider. Denne teknik hurtigt bevist fordelagtigt i forhold til dets løsning-fase forgænger i både tid og arbejdskraft. Forbedringer vedrørende arten af fast støtte, de beskyttende grupper ansat og koblingen anvendte metoder i løbet af de sidste fem årtier har kun øget nytten af Merrifield oprindelige system. Dag, anvendelse af en Boc-baseret beskyttelse og base / nukleofil fraspaltelig harpiks strategi eller Fmoc beskyttelses-og sure spaltelig harpiks strategi udviklet af RC Sheppard, der mest almindeligt anvendes til syntese af peptider 1.
Inspireret af Merrifield solide understøttet strategi har vi udviklet en Boc / tert-butyl fastfasesyntese strategi for samling af funktionaliserede bis-peptider 2, som er beskrevet heri. Anvendelse af fast-fase syntese sammenlignet to opløsning-fase metode er ikke blot fordelagtigt i tid og arbejdskraft, som beskrevet af Merrifield 1, men tillader også større lethed ved syntese af bis-peptidbiblioteker. Syntesen at Vi viser her omfatter en afsluttende spaltning trin, der anvender en totrins-"sikkerheds"-mekanisme for at frigive den funktionaliserede bis-peptidet fra harpiksen ved diketopiperazin-dannelse.
Bis-peptider er stive, spiro-ladder oligomerer af bis-aminosyrer, der er i stand til at positionere funktionalitet i en forudsigelig og designable måde, der kontrolleres af typen og stereokemien af de monomere enheder, og forbindelsen mellem hver monomer. Hver bis-aminosyre er en stereokemisk ren cyklisk skelet, der indeholder to aminosyrer (en carboxylsyre med en α-amin) 3,4. Vores laboratorium øjeblikket undersøge potentialet af funktionelle bis-peptider på tværs af en lang række områder, herunder katalyse og protein-protein interaktioner og nanomaterials.
Den syntetiske fremgangsmåde er præsenteret heri tilvejebringer en fremgangsmåde til syntese af funktionaliserede bis-peptider fra bis-aminosyre byggeblokke anvender fælles fastfase-peptidsynteseteknikker. Den monomer syntese af disse "Pro4" byggeklodser fra trans-4-hydroxyprolin 3 er meget skalerbar og er blevet afsluttet til hydantoin scenen på en 600 mmol (234 g) skala (ikke offentliggjort). Når de monomerer er i hånden, anvendelse af fastfase-teknikker tilvejebringer en hurtigere metode til bis-peptidsyntese end vores nuværende opløsning-fase metode 4 ved at eliminere behovet for reaktionen arbejde op-og mellemliggende oprensninger.
Den primære udfordring i fast-fase syntese diagnosticere syntetisk fremskridt og problemløsning da ingen mellemprodukter isoleres. Dette har ført til udviklingen af mange kolorimetriske tests, herunder dem, der angiver, om frie aminer (Kaiser test 10) eller frit hydroxyls (methylrødt Test 7) udsættes for harpiks. Uheldigvis er almindeligt anvendte Kaiser-test 10 er generelt ikke anvendes i vores fastfasesyntese på grund af den næsten udelukkende anvendelse af sekundære aminer eller aminer bundet til et kvaternært carbonatom. Andre muligheder for vurdering af HMBA harpiks indbefatter test skel ved hjælp af en nukleofil, såsom hydrazin 11, kvantitativ Fmoc spaltning overvåges af UV / Vis 1,11, og indfangning og analysere indkommende aktiverede forbindelser.
Et andet overset problem i fast-fase syntese er den repetitive natur af syntetiske trin, der kræves af brugeren. Med dette in mente, forfatterne anbefaler brug af et regneark eller en tjekliste, når du udfører en manuel fast-fase-peptidsyntese.
Den vanskeligt at bruge bis-peptider til fast-fase syntese sammenlignet med almindelige α-aminosyrer omfatter potentialet for mere vanskeligt koblinger på grund af sterisk hindrance, behovet for on-harpiks diketopiperazin lukninger, og samtidige afbeskyttelser (Boc / tBu; Cbz / tBu). Anden vanskeligt ligger opnå kvantitativ afgivelse fra harpiksen ved anvendelse af denne "sikkerhedslåsen"-metoden i sammenligning med mere konventionelle midler. Med disse faktorer in mente, er det meget muligt, at yderligere optimering af denne metode kan opnås, og den nuværende indsats er i gang i vores gruppe for at forbedre den metode, der præsenteres her.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dr. Zachary Z. Brown og Jennifer Alleva for den indledende udvikling af denne fastfasesyntesen teknik og Matthew FL Parker for nyttige diskussioner. Dette arbejde understøttes af Defense Threat Reduction Agency (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) og Horst Witzel Fellowship Award støttes af Cephalon, Inc.
Name | Company | Catalogue Number | Comments |
HMBA-Am Resin | NovaBiochem | 855018 | |
MSNT | NovaBiochem | 851011 | |
NMI | Sigma-Aldrich | 336092 | Toxic, Corrosive |
DCM | Sigma-Aldrich | D65100 | Carcinogenic |
Anhydrous DCM | Acros | 34846 | Carcinogenic |
33% Hydrogen Bromide in Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 248630 | Toxic, Corrosive, Fumes when open |
DIPEA | Sigma-Aldrich | 387649 | Flammable, Toxic, Corrosive |
DMF | Fisher Scientific | AC27960 | Flammable, Toxic |
Anhydrous DMF | Acros | 34843 | Flammable, Toxic |
HOAt | GenScript | C01568 | |
DIC | Acros | BP590 | Flammable, Toxic, Corrosive |
TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | Toxic, Corrosive |
TIPS | Acros | 21492 | Flammable, Toxic |
Piperidine | Sigma-Aldrich | 104094 | Flammable, Toxic, Corrosive |
HATU | GenScript | C01566 | Toxic |
NMP | Acros | 36438 | Toxic |
DMAP | NovaBiochem | 851055 | Toxic |
Methyl Red | Sigma-Aldrich | 250198 | |
THF | Sigma-Aldrich | 401757 | Flammable, Toxic, Peroxide Forming |
Pyrrolidine | Sigma-Aldrich | P73803 | Flammable, Toxic, Corrosive |
Dimethyl Sulfoxide | Fisher | D1281 | |
SPPS Reaction Vessels | Grace | 211108 | |
LCMS | Agilent | 1200 Series | |
Semi-Prep LC | Hewlett Packard | 1100 Series | |
Lyophilizer | Labconco | 7934027 | |
Rotovapor | Buchi | R-210 Series | |
Argon | Airgas | AR PP300CT |