एकल और multicellular संदर्भों में invadopodia मध्यस्थता कोशिकी मैट्रिक्स proteolysis के मात्रात्मक मापन
Summary
हम खुर्दबीन invadopodia की मध्यस्थता मैट्रिक्स गिरावट visualizing के लिए फ्लोरोसेंट जेलाटीन के साथ लेपित coverslips के उत्पादन के लिए prototypical विधि का वर्णन है. कम्प्यूटेशनल उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग तकनीक एक मिश्रित आबादी के भीतर और multicellular पूरे सूक्ष्म क्षेत्रों को शामिल समूहों के लिए एकल कक्षों के द्वारा मैट्रिक्स proteolysis के परिणामस्वरूप स्तर बढ़ाता के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं.
Abstract
स्थानीय ऊतकों में सेलुलर आक्रमण विकास और homeostasis में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है. Malregulated आक्रमण और बाद में सेल आंदोलन सूजन, हृदय रोग और ट्यूमर सेल 1 मेटास्टेसिस सहित कई रोग प्रक्रियाओं की विशेषता है. उपकला या endothelial तहखाने झिल्ली में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) घटकों के Focalized proteolytic गिरावट सेलुलर आक्रमण की शुरुआत में एक महत्वपूर्ण कदम है. ट्यूमर कोशिकाओं में, इन विट्रो विश्लेषण में व्यापक निर्धारित किया है कि ईसीएम गिरावट उदर actin अमीर झिल्ली उत्क्षेपणशील 2,3 invadopodia करार दिया संरचनाओं के द्वारा पूरा किया है. ईसीएम, जहां वे मैट्रिक्स metalloproteinases (एमएमपी) की कार्रवाई के माध्यम से उदारवादी ECM टूटने के करीब समानाधिकरण में invadopodia फार्म. ट्यूमर कोशिकाओं की क्षमता को invadopodia फार्म सीधे स्थानीय stroma और संबद्ध संवहनी उपकरणों 3 में आक्रमण करने की क्षमता के साथ संबद्ध है.
> invadopodia की मध्यस्थता फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं डाई लेबल मैट्रिक्स कांच coverslips पर लेपित प्रोटीन का उपयोग ECM गिरावट के विज़ुअलाइज़ेशन _content "मैट्रिक्स proteolysis और सेलुलर आक्रामक क्षमता 4,5 की डिग्री का मूल्यांकन करने के लिए सबसे अधिक प्रचलित तकनीक के रूप में उभरा है, यहाँ हम का वर्णन है. fluorescently लेबल कांच coverslips का उपयोग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ओरेगन ग्रीन 488 जिलेटिन संयुग्म पैदा करने के लिए मानक विधि का एक संस्करण इस विधि आसानी से तेजी से लेपित coverslips की बड़ी संख्या का उत्पादन बढ़ाया है. हम आम सूक्ष्म कलाकृतियों कि अक्सर सामना कर रहे हैं की कुछ दिखाने इस प्रक्रिया के दौरान और कैसे इन. बचा जा सकता है अंत में, हम मानकीकृत आसानी से उपलब्ध कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए लेबल जेलाटीन मैट्रिक्स व्यक्ति की कोशिकाओं और पूरे सेलुलर आबादी द्वारा मध्यस्थता गिरावट की मात्रा का ठहराव की अनुमति विधियों का वर्णन करती है. वर्णित प्रक्रियाओं सही और reproducibly की निगरानी करने की क्षमता प्रदान करते हैं invadopodiaगतिविधि है, और भी प्रोटीन अभिव्यक्ति modulating या एकल और multicellular सेटिंग में बाह्य मैट्रिक्स गिरावट पर विरोधी इनवेसिव यौगिकों के परीक्षण की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए एक मंच के रूप में सेवा कर सकते हैं.Protocol
1. ओरेगन ग्रीन के उत्पादन 488 जेलाटीन लेपित Coverslips 1.25 छ जिलेटिन और पीबीएस में 1.25 ग्राम 50 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा sucrose जोड़कर एक unlabeled 5% (w / w) स्टॉक जिलेटिन / sucrose समाधान तैयार. शेयर 37 डिग्री सेल्सियस जिलेटिन समा?…
Discussion
कोशिकी मैट्रिक्स अपमानजनक कोशिकाओं कल्पना करने की क्षमता आणविक सेल आक्रमण के प्रारंभिक चरणों में कार्यरत तंत्र की खोज में सहायता प्राप्त है. 4,14,15 जल्दी है 1980 में वेन टीएन चेन ने बीड़ा उठाया है, बाद म…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
बंदोबस्ती धन के द्वारा यह काम पश्चिम वर्जीनिया विश्वविद्यालय मैरी Babb Randolph कैंसर केंद्र से समर्थन किया था. हम जल्दी सलाह और सहायता के लिए Susette मुलर (जॉर्ज टाउन विश्वविद्यालय) और लौरा Kelley धन्यवाद. पश्चिम वर्जीनिया विश्वविद्यालय माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सुविधा का उपयोग करें (मैरी Babb Randolph कैंसर केंद्र और, एनआईएच P20 अनुदान RR16440, RR032138 P30 और GM103488 P30 द्वारा समर्थित) कृतज्ञता से स्वीकार किया है.
Materials
| Name of Reagent/Instrument | Company | Catalogue Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
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Cite This Article
Martin, K. H., Hayes, K. E., Walk, E. L., Ammer, A. G., Markwell, S. M., Weed, S. A. Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts. J. Vis. Exp. (66), e4119, doi:10.3791/4119 (2012).