Mesure quantitative de invadopodes la protéolyse matrice extracellulaire dans des contextes simples et multicellulaire
Summary
Nous décrivons la méthode prototype pour la fabrication des lamelles de microscope recouvertes de gélatine fluorescente pour visualiser dégradation de la matrice invadopodes médiation. Techniques de calcul à l'aide du logiciel disponible sont présentées pour quantifier les niveaux résultants de protéolyse de la matrice de cellules individuelles au sein d'une population mixte et des groupes pluricellulaires englobant ensemble des champs microscopiques.
Abstract
L'invasion cellulaire dans les tissus locaux est un processus important dans le développement et l'homéostasie. Malregulated invasion et le mouvement cellulaire ultérieur est caractéristique de plusieurs processus pathologiques, notamment l'inflammation, les maladies cardiovasculaires et la métastase des cellules tumorales 1. Dégradation protéolytique focalisée de la matrice extracellulaire (ECM) des composants de la membrane basale épithéliale ou endothéliale est une étape critique dans le lancement invasion cellulaire. Dans les cellules tumorales, en matière d'analyse in vitro a déterminé que la dégradation de l'ECM est accompli par ventrales structures membranaires riches en actine propulsion appelés invadopodes 2,3. Forme invadopodes en apposition étroite l'ECM, où ils modèrent répartition ECM grâce à l'action des métalloprotéases matricielles (MMP). La capacité des cellules tumorales à former invadopodes est directement corrélée avec la capacité d'envahir le stroma locale et ses composants vasculaires 3.
_content "> Visualisation de invadopodes médiation dégradation de la MEC des cellules par microscopie à fluorescence en utilisant des protéines de la matrice colorant marqués enduits sur des lamelles de verre s'est imposée comme la technique la plus répandue pour évaluer le degré de protéolyse de la matrice cellulaire et potentiel invasif 4,5. Ici, nous décrivons une version de la méthode standard pour générer des lamelles de verre à marquage fluorescent en utilisant un commerce Oregon Green-488 conjugué gélatine. Cette méthode est facilement mis à l'échelle pour produire rapidement un grand nombre de lamelles recouvertes. Nous montrons une partie des artefacts communs microscopiques qui sont souvent rencontrées au cours de cette procédure et comment ceux-ci peuvent être évités. Enfin, nous décrivons des méthodes normalisées au moyen de logiciels facilement disponibles pour permettre une quantification de la dégradation de la matrice de gélatine étiquetés médiée par des cellules individuelles et par l'ensemble des populations cellulaires. Les procédures décrites permettent de surveiller avec précision et de façon reproductible invadopodesactivité, et peuvent aussi servir de plateforme pour l'évaluation de l'efficacité de modulation de l'expression des protéines ou des tests anti-invasives composés sur la dégradation de la matrice extracellulaire dans des cadres uniques et multicellulaire.Protocol
Discussion
La possibilité de visualiser les cellules dégradant la matrice extracellulaire a aidé à découvrir les mécanismes moléculaires utilisés dans les étapes précoces de l'invasion cellulaire. Mis au point par Wen-Chen Tien dans le début des années 1980 4,14,15, revêtement marquées par fluorescence des protéines extracellulaires sur des lamelles de verre pour analyse microscopique ultérieur est apparue comme la principale technique dans l'évaluation de la fonction invadopodes dans un large ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des fonds de dotation de l'Université West Virginia Mary Babb Randolph Cancer Center. Nous remercions Susette Mueller (Georgetown University) et Laura Kelley pour obtenir des conseils et de l'aide au début. L'utilisation de la facilité de West Virginia University Imaging Microscopy (soutenu par le Mary Babb Randolph Cancer Center, et des subventions du NIH P20 RR16440, P30 et P30 RR032138 GM103488) est grandement appréciée.
Materials
| Name of Reagent/Instrument | Company | Catalogue Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
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