Vi beskriver den prototypiske fremgangsmåde til fremstilling mikroskop dækglas overtrukket med fluorescerende gelatine til visualisering invadopodia-medieret matrix-nedbrydning. Computational teknikker, der anvender tilgængelig software præsenteres til kvantificering de resulterende niveauer af matrix proteolyse af enlige celler i en blandet befolkning og for flercellede grupper, som udøver hele mikroskopiske felter.
Cellular invasion i lokale væv er en proces vigtig for udvikling og homeostase. Malregulated invasion og efterfølgende cellebevægelse er karakteristisk for mange patologiske processer, herunder inflammation, cardiovaskulær sygdom og tumorcellemetastase 1. Focalized proteolytisk nedbrydning af ekstracellulær matrix (ECM) komponenter i epitel eller endotel basalmembran er et kritisk trin til at initiere cellulær invasion. I tumorceller, har omfattende in vitro-analyse fastslået, at ECM-nedbrydning opnås ved ventrale actin-rige membran protrusive strukturer betegnet invadopodia 2,3. Invadopodia form i tæt apposition til ECM, hvor de moderat ECM nedbrydning ved virkningen af matrixmetalloproteinaser (MMP'er). Evnen af tumorceller til dannelse invadopodia korrelerer direkte med evnen til at invadere til lokal stroma og vaskulære komponenter 3.
_content "> Visualisering af invadopodia-medieret ECM nedbrydning af cellerne ved fluorescensmikroskopi under anvendelse farvestof-mærkede matrixproteiner coatet på dækglas har vist sig som den mest udbredte teknik til evaluering af graden af matrix proteolyse og cellulære invasive potentiale 4,5. Her beskriver vi en version af standard metode til frembringelse af fluorescens-mærkede dækglas under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt Oregon Green-488 gelatine konjugat. Denne metode er let skaleres til hurtigt at producere et stort antal overtrukne dækglas. Vi viser nogle af de fælles mikroskopiske artefakter, som man ofte støder på under denne procedure, og hvordan disse kan undgås. Endelig beskriver vi standardiserede fremgangsmåder under anvendelse af let tilgængelige computer software for at tillade kvantificering af mærket gelatine matrixnedbrydning medieret af individuelle celler og i hele cellepopulationer. De beskrevne fremgangsmåder giver mulighed for nøjagtigt og reproducerbart overvåge invadopodiaaktivitet, og kan også tjene som en platform for at evaluere effekten af at modulere protein-ekspression eller prøvning af anti-invasive forbindelser på ekstracellulær matrixnedbrydning i enkelt-og flercellede indstillinger.Evnen til at visualisere cellerne nedbryde den extracellulære matrix har bidraget til at finde de molekylære mekanismer anvendt i de tidlige trin i celleinvasion. Udviklet af Wen-Tien Chen i begyndelsen af 1980'erne 4,14,15, har coating fluorescensmærkede ekstracellulære proteiner på dækglas til efterfølgende mikroskopisk analyse vist sig som den primære metode at vurdere invadopodia funktion på en lang række celletyper. Den foreskrevne protokol viser den grundlæggende metode til fremstilling a…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af begavelse midler fra West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. Vi takker Susette Mueller (Georgetown University) og Laura Kelley for tidlig rådgivning og assistance. Brugen af West Virginia University Microscopy Imaging Facility (støttet af Mary Babb Randolph Cancer Center, og NIH tilskud P20 RR16440, P30 RR032138 og P30 GM103488) er modtaget med tak.
Name of Reagent/Instrument | Company | Catalogue Number | Comments |
gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
sucrose | Fisher | BP220 | |
12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
NIS Elements software | Nikon |