Kvantitativ måling af Invadopodia-medieret ekstracellulær matrix Proteolyse i Single og flercellede Contexts
Summary
Vi beskriver den prototypiske fremgangsmåde til fremstilling mikroskop dækglas overtrukket med fluorescerende gelatine til visualisering invadopodia-medieret matrix-nedbrydning. Computational teknikker, der anvender tilgængelig software præsenteres til kvantificering de resulterende niveauer af matrix proteolyse af enlige celler i en blandet befolkning og for flercellede grupper, som udøver hele mikroskopiske felter.
Abstract
Cellular invasion i lokale væv er en proces vigtig for udvikling og homeostase. Malregulated invasion og efterfølgende cellebevægelse er karakteristisk for mange patologiske processer, herunder inflammation, cardiovaskulær sygdom og tumorcellemetastase 1. Focalized proteolytisk nedbrydning af ekstracellulær matrix (ECM) komponenter i epitel eller endotel basalmembran er et kritisk trin til at initiere cellulær invasion. I tumorceller, har omfattende in vitro-analyse fastslået, at ECM-nedbrydning opnås ved ventrale actin-rige membran protrusive strukturer betegnet invadopodia 2,3. Invadopodia form i tæt apposition til ECM, hvor de moderat ECM nedbrydning ved virkningen af matrixmetalloproteinaser (MMP'er). Evnen af tumorceller til dannelse invadopodia korrelerer direkte med evnen til at invadere til lokal stroma og vaskulære komponenter 3.
_content "> Visualisering af invadopodia-medieret ECM nedbrydning af cellerne ved fluorescensmikroskopi under anvendelse farvestof-mærkede matrixproteiner coatet på dækglas har vist sig som den mest udbredte teknik til evaluering af graden af matrix proteolyse og cellulære invasive potentiale 4,5. Her beskriver vi en version af standard metode til frembringelse af fluorescens-mærkede dækglas under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt Oregon Green-488 gelatine konjugat. Denne metode er let skaleres til hurtigt at producere et stort antal overtrukne dækglas. Vi viser nogle af de fælles mikroskopiske artefakter, som man ofte støder på under denne procedure, og hvordan disse kan undgås. Endelig beskriver vi standardiserede fremgangsmåder under anvendelse af let tilgængelige computer software for at tillade kvantificering af mærket gelatine matrixnedbrydning medieret af individuelle celler og i hele cellepopulationer. De beskrevne fremgangsmåder giver mulighed for nøjagtigt og reproducerbart overvåge invadopodiaaktivitet, og kan også tjene som en platform for at evaluere effekten af at modulere protein-ekspression eller prøvning af anti-invasive forbindelser på ekstracellulær matrixnedbrydning i enkelt-og flercellede indstillinger.Protocol
Discussion
Evnen til at visualisere cellerne nedbryde den extracellulære matrix har bidraget til at finde de molekylære mekanismer anvendt i de tidlige trin i celleinvasion. Udviklet af Wen-Tien Chen i begyndelsen af 1980'erne 4,14,15, har coating fluorescensmærkede ekstracellulære proteiner på dækglas til efterfølgende mikroskopisk analyse vist sig som den primære metode at vurdere invadopodia funktion på en lang række celletyper. Den foreskrevne protokol viser den grundlæggende metode til fremstilling a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af begavelse midler fra West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. Vi takker Susette Mueller (Georgetown University) og Laura Kelley for tidlig rådgivning og assistance. Brugen af West Virginia University Microscopy Imaging Facility (støttet af Mary Babb Randolph Cancer Center, og NIH tilskud P20 RR16440, P30 RR032138 og P30 GM103488) er modtaget med tak.
Materials
| Name of Reagent/Instrument | Company | Catalogue Number | Comments |
| gelatin | Sigma | G1890 | Porcine skin |
| sucrose | Fisher | BP220 | |
| 12 mm coverslips | Fisher | 50-121-5159 | |
| 24 well plates | Fisher | 08-772-1 | BD Falcon |
| nitric acid | Ricca | R5326000 | 20% solution |
| poly-L-lysine | Electron Microscopy Sciences | 19320-B | 0.1% solution |
| glutaraldehyde | Sigma | G7526 | 8% solution |
| Oregon Green 488-conjugated gelatin | Invitrogen | G-13186 | |
| sodium borohydride | Sigma | 213462 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | |
| rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| anti-cortactin (clone 4F11) | Millipore | 05-180 | |
| Anti-FLAG antibody | Millipore | MAB3118 | |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A21235 | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| LSM 510 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| AutoQuant X2.2 software | Media Cybernetics | ||
| NIS Elements software | Nikon |
References
- Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The ‘ins’ and ‘outs’ of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).
- Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src. Nature. 316, 156-158 (1985).
- Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function. Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).
- Ayala, I., et al. Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation. J. Cell Sci. , (2008).
- Ammer, A. G., et al. Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function. J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).
- Seals, D. F., et al. The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells. Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).
- Yamaguchi, H., et al. Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin. J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).
- Kopp, P., et al. The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages. Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).
- Oser, M., et al. Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation. J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Kelley, L. C., et al. Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation. J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).
- Chen, W. T., Singer, S. J. Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).
- Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites. J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).
- Bharti, S., et al. Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes. Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).
- Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity. Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).
- Scott, R. W., et al. kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).
- Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells. J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).
- Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro. Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).
- Baldassarre, M., et al. Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells. Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. ECM degradation assays for analyzing local cell invasion. Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).
- Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia. J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).
- Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia. Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation. J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).
- Li, A., et al. The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion. Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).
- Yamaguchi, H., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells. Cancer Sci. , (2010).
