Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

Summary

Isolamento de crista neural embrionário a partir do tubo neural facilita o uso de<em> In vitro</em> Métodos para estudar a migração, a auto-renovação, e multipotency da crista neural.

Abstract

O embrionário da crista neural (NC) é uma população de células progenitoras multipotentes que origina na face dorsal do tubo neural, sofre uma transição epitelial para mesenquimal (TEM) e migra ao longo do embrião, dando origem a diversos tipos celulares ^1-3. NC também tem a capacidade única de influenciar a diferenciação e maturação de órgãos-alvo ^4-6. Quando explantado in vitro, células progenitoras de NC submetidos a auto-renovação, migrar e diferenciam-se em uma variedade de tipos de tecidos incluindo neurónios, células gliais, células musculares lisas, cartilagem e do osso.

Multipotency de NC foi descrita pela primeira vez a partir de explantes do tubo neural aviária ^7-9. Em isolamento in vitro de células de NC facilita o estudo de NC dinâmica, incluindo a proliferação, migração e multipotency. Trabalho adicional nos sistemas de aves e de rato demonstraram que as células explantadas NC NC reter o seu potencial quando transplantadas de volta para o embrião ¹⁰-13. Como essas propriedades inerentes celulares são preservadas em progenitores explantadas NF, o ensaio de explante tubo neural fornece uma opção atrativa para o estudo da NC in vitro.

Para alcançar uma melhor compreensão da NC mamíferos, muitos métodos têm sido utilizados para isolar populações NC. NC-derivados progenitores podem ser cultivadas a partir de pós-migratórias locais em ambos o embrião e adulto para estudar a dinâmica dos progenitores pós-migratórias NC ^11,14-20, no entanto isolamento de células progenitoras de NC como eles emigram a partir do tubo neural fornece preservação óptima de NC célula potencial e propriedades migratórias ^13,21,22. Alguns protocolos empregar separação de células activadas por fluorescência (FACS) para isolar uma população enriquecida para NC progenitores particulares ^11,13,14,17. No entanto, quando se inicia com embriões na fase inicial, os números de células adequadas para as análises são difíceis de obter com FACS, complicando o isolamento de início NC populations a partir de embriões individuais. Aqui, descrevemos uma abordagem que não depende de FACS e resultados em uma população de aproximadamente 96% NC puro com base em uma Wnt1-Cre repórter linhagem ativado ^23.

O método aqui apresentado é uma adaptação de protocolos otimizados para a cultura do rato NC ^11,13. As vantagens deste protocolo, em relação aos métodos anteriores são de que 1) as células não são cultivadas em uma camada alimentadora, 2) FACS não é necessário para obter uma população relativamente puro NC, 3) células premigratory NF são isolados e 4) os resultados são facilmente quantificado. Além disso, este protocolo pode ser utilizado para o isolamento de NC a partir de qualquer modelo de rato mutante, facilitando o estudo das características NF com diferentes manipulações genéticas. A limitação desta abordagem é que o NF é removido a partir do contexto do embrião, o que é conhecido para influenciar a sobrevivência, a migração ea diferenciação do NC ^2,24-28.

Protocol

1. Placas de Preparação Use técnica estéril em todos os momentos. Preparar fibronectina (FN) por diluição de 100 ul de estoque humano FN plasma para um volume final de 3,3 mL em PBS de Dulbecco (DPBS). Concentração final é de 30 ug / mL e esta pode ser armazenada a 4 ° C durante 1 semana. Cobrir parte inferior de cada poço de uma cultura de tecidos estéril quatro placa bem com uma solução de FN e deixar assentar durante 15 minutos. Certifique-se de toda a superfície é cober…

Discussion

Atenção especial deve ser dada à fase de desenvolvimento do embrião para garantir o sucesso desta abordagem. Contando somitos de embriões de rato é fundamental tanto para a fase correspondente embriões dentro de uma maca e determinar as regiões corretas do tubo neural para o isolamento. Uma variação de um ou dois sómitos entre os embriões está dentro de uma gama razoável de tempo de desenvolvimento, dependendo da resolução da experiência realizada. Um embrião entre 9 e 9,5 dpc terá entre 17 e 25 somit…

Materials

Reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMEM (low glucose)	Gibco/Invitrogen	11885
Neurobasal Medium	Gibco	21103
BSA	Sigma	A3912-10G
dPBS	Gibco	14190-144
IGF1	BD Biosciences	354037	Store in 50 μg/mL aliquots at -20°C.
bFGF	BD Biosciences	354060	Store in 25 μg/mL aliquots at -20°C.
Fibronectin	Gibco	33016-015	Stored in 1mg/mL aliquots at -20°C.
Retinoic acid	Sigma	R2625	Store in 35 μg/ml aliquots after reconstituting in ethanol at -20°C.
2-mercaptoethanol	Sigma	D-5637
N2 supplement	Gibco	17502-048
B27 supplement	Gibco	17504-044
Steriflip 0.22 μm filters	Millipore	SCGP00525
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140122
0.20 μm filters	Corning	431219
Syringes (for filtration)	BD Biosciences	301604
Four well plates	Thermo Fisher Scientific	176740
Collagenase/Dispase	Roche	269 638	Activity varies by batch. Store in 100 mg/mL aliquots at -20°C.
Insulin needles (29½ gage)	Becton Dickson	309306
Hypoxia Chamber	Billups-Rothenberg
Oxygen Analyzer	Billups-Rothenberg
Forceps #5	Fine Science Tools		For removing uterus and decidua.
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200