संक्रामक murine Norovirus की रिवर्स आनुवंशिकी मध्यस्थता रिकवरी

Summary

Noroviruses उनके लक्षण वर्णन के लिए एक आंत्रशोथ अभी तक आणविक तकनीक का एक प्रमुख कारण हैं अभी भी अपेक्षाकृत नया है. यहाँ हम दो अलग murine (MNV) norovirus, इस जीनस केवल सदस्य जो सेल संस्कृति में प्रचारित किया जा सकता है के कुशल वसूली के लिए रिवर्स आनुवंशिकी दृष्टिकोण की रिपोर्ट.

Abstract

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided ^{1, 2}. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture ³. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus ⁴ but which can be propagated in cells ⁵ has opened new avenues for the investigation of these pathogens ^{6, 7}.

MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) ⁸.

Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery ^9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5′ end of both genomic and subgenomic RNAs ^12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches.

Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5′ end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis ^15-17.

Protocol

1. शाही सेना ट्रांसक्रिप्शन और संक्रामक MNV की वसूली के लिए कैपिंग इस प्रोटोकॉल के माध्यम से इन विट्रो प्रतिलेखन और इन विट्रो में बाद कैपिंग (1.1 अनुभाग) में सीडीएनए से संक्रामक MNV के कुशल वसूली की अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किया गया है. परिणामस्वरूप छाया टेप तो कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट संक्रामक MNV (1.2 वर्गों और 1.3) ठीक है. यह दृष्टिकोण MNV ठेठ पैदावार के साथ 35 मिमी प्रति 10 5 संक्रामक इकाइयों (व्यास में) MNV के लिए कोशिकाओं के पकवान से अधिक की वसूली के लिए सबसे संवेदनशील तरीका प्रदान करता है. प्रोटोकॉल नीचे विस्तृत है: 1.1 संक्रामक छाया MNV टेप के संश्लेषण: के साथ Nhe मैं रैखिक डीएनए Nhe प्राप्त करने के लिए मैं 3 'MNV जीनोम के अंत Pólya पूंछ (चित्रा 2) के बाद एक अद्वितीय प्रतिबंध साइट को पहचानता है.: जंगली प्रकार सीडीएनए (3'Rz MNV pT7) MNV युक्त प्लाज्मिड डाइजेस्ट. Linearised प्लास्मिड आम तौर पर शुद्ध कर रहे हैंसिलिका स्तंभों (जैसे GFX पीसीआर डीएनए जीई हेल्थकेयर से जेल बैंड शोधन किट) का उपयोग कर और एच 2 ओ में eluted के साथ इन विट्रो में linearised T7 शाही सेना पोलीमरेज़ का उपयोग कर के रूप में पहले 17 में वर्णित वेक्टर टाइप करना. कई वाणिज्यिक किट इस उद्देश्य के लिए उपलब्ध हैं और (जीवन टेक्नोलॉजीज) MEGAScript और RiboMAX (Promega) के रूप में शाही सेना संश्लेषण की बड़ी मात्रा की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रदान करते हैं. प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं आमतौर पर DNase रहे हैं आगे के विश्लेषण के लिए पहले से पचता है, लेकिन कई मामलों में इस लिथियम क्लोराइड Purifications के रूप में की आवश्यकता नहीं के रूप में नीचे वर्णित कुशलतापूर्वक वेग नहीं डीएनए है. आरएनए प्रतिलेखन प्रतिक्रिया का एक छोटा सा अशेष भाजक का विश्लेषण, आम तौर पर 0.5 μl या कम agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा, प्रतिलेखन प्रतिक्रिया सुनिश्चित कुशलता से काम किया है और शाही सेना के पूर्ण लंबाई है. के रूप में कई प्रयोक्ताओं के लिए सही ढंग से आकार शाही सेना जैल denaturing चलाने के लिए चाहते हो सकता है, हम आम तौर पर agarose जेल electrophor गैर denaturing उपयोगesis आरएनए अखंडता का विश्लेषण करने के लिए एक तेजी से विधि के रूप में. MNV जीनोम के रूप में – संक्रामक सीडीएनए क्लोन pT7 से उत्पादित: MNV 3'Rz लगभग 3 एक गैर denaturing agarose जेल (चित्रा 3) पर एक dsDNA सीढ़ी के सापेक्ष KBP पर चलेंगे. विचार करना है कि अन्य विधियों के एक विकल्प के रूप में उपलब्ध हैं एक Agilent के bioanalyser (चित्रा 3) का उपयोग कर के रूप में शाही सेना अखंडता की एक तेजी से विश्लेषण प्राप्त. नोट करें कि गरीब जेल संकल्प अगर बहुत ज्यादा शाही सेना से भरी हुई है सामना हो सकता है. महान देखभाल करने के लिए सुनिश्चित करें agarose जेल RNase मुक्त अभिकर्मकों का उपयोग वैद्युतकणसंचलन जो बैंड संकल्प को प्रभावित कर सकते हैं के दौरान शाही सेना गिरावट से बचने के लिए तैयार है. 65 से शाही सेना हीटिंग डिग्री सेल्सियस पर बर्फ ठंडा भी कुछ मामलों में मदद कर सकते हैं द्वारा पीछा किया. शाही सेना नमूना शुद्ध से अनिगमित nucleotides को दूर करने के लिए. इस सिलिका सहित स्तंभ आधारित दृष्टिकोण के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं लेकिन इस प्रोटोकॉल में हम आम तौर पर एक लागत प्रभावी विकल्प के रूप में लिथियम क्लोराइड का उपयोग करें. के लिएइस उद्देश्य, एच 2 हे जोड़ने के लिए 100 μl की अंतिम मात्रा तक पहुँचने और फिर लिथियम क्लोराइड तेज़ी समाधान (7.5 एम LiCl, 50 मिमी EDTA, 8.0 पीएच, Ambion) के 40 μl जोड़ने और -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना की दुकान कम से कम 30 मिनट. 12,000 एक्स जी में 4 बजे centrifugation द्वारा गोली शाही सेना ° सी 15 मिनट के लिए. निकालें सतह पर तैरनेवाला, देखभाल करने के लिए पारदर्शी शाही सेना गोली परेशान नहीं है और यह 70% इथेनॉल 150 μl में धो. 12,000 एक्स जी में 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र. इथेनॉल और हवा शुष्क शाही सेना निकालें, गोली से बचने के लिए पूरी तरह से इस रूप में बाहर सूखी मेजबान मुश्किल कर देगा. तो, शाही सेना भंडारण समाधान (Ambion) के 50-100 μl में MNV टेप resuspend. देखभाल ठीक से सभी शाही सेना को भंग कर दिया है करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए. शाही सेना पूरी तरह से भंग मुश्किल में प्रकट होने चाहिए, 60 के लिए नमूना हीटिंग डिग्री सेल्सियस यह resuspend मदद मिल सकती है. किसी भी अघुलनशील सामग्री तो हटा दिया जाना चाहिएy मात्रा का ठहराव शाही सेना में पूर्व centrifugation. शुद्ध टेप और uncapped कर रहे हैं और इन विट्रो कैपिंग कदम में एक बाद में करने के लिए संक्रामक हो सकता है (ScriptCap m7G कैपिंग प्रणाली, Epicentre की जैव प्रौद्योगिकी) की आवश्यकता होती है. Spectrophotometry द्वारा शाही सेना की मात्रा ठहराना. प्रकृति और प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के पैमाने पर निर्भर करता है, ठेठ पैदावार 100 μl प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के प्रति शाही सेना के 50-150 μg से लेकर. शाही सेना की अखंडता के बाहर एक 1% agarose जेल (चित्रा 3) में नमूना के 100-300 एनजी चलाकर कैपिंग प्रतिक्रिया से पहले विश्लेषण किया जाना चाहिए. शाही सेना की दक्षता में सुधार कैपिंग, ट्यूब गर्मी 65 में 60 से 70 MNV शाही सेना टेप के μg ° सी 10 मिनट के लिए और फिर तुरंत जगह बर्फ पर. इस कदम कैपिंग पर किसी भी शाही सेना संरचना की निरोधात्मक प्रभाव को कम कर सकते हैं. एक ठंडा हीटिंग चरण के दौरान गठन बूंदों लेने microfuge में ट्यूब नाड़ी. एक कैपिंग प्रतिक्रिया मिश्रण की तैयारी के रूप में निर्माता ने सुझाव दिया है (ScriptCap m7Gकैपिंग प्रणाली, Epicentre जैव प्रौद्योगिकी). संक्षेप में, 100 μl की अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा MNV शाही सेना के 60-70 μg जोड़ें. कैपिंग प्रतिक्रिया मिश्रण 10 बफर कैपिंग एक्स की 10 μl (500 मिमी TrisHCl 8.0 पीएच, 60 मिमी KCl, 12.5 मिमी MgCl2), 10 मिमी जीटीपी 10 μl, 20 मिमी एस – adenosyl methionine, Scriptguard की 2.5 μl 0.5 μl शामिल कर सकते हैं (100 इकाइयों), और Scriptcap एंजाइम की 4 μl (40 इकाइयों). की स्थापना की प्रतिक्रिया के दौरान, शाही सेना के लिए बर्फ पर टेप गिरावट से बचने के रखना. अच्छी तरह से प्रतिक्रिया मिश्रण मिश्रण है और फिर 37 ° C पर यह 1 घंटे के लिए सेते हैं. नोट प्रतिक्रिया आकार की छाया प्रतिलिपि आवश्यक राशि के अनुसार बढ़ाया जा सकता है. LiCl तेज़ी से शाही सेना शुद्ध जैसा कि ऊपर बताया (1.1.6 बिंदु देखें). शाही सेना भंडारण समाधान (Ambion) के 50-100 μl में गोली भंग और शाही सेना की राशि मात्रा ठहराना. आमतौर पर, शाही सेना के नमूने बाद में 1 μg / μl सामान्यीकृत कर रहे हैं. फिर से जाँच करें, सभी शाही सेना को ठीक से भंग कर दिया है. अगर यह ठीक से नहीं किया गया भंग कर दिया है, गर्मी टीवह नमूना से 60 डिग्री सेल्सियस उसके विघटन की अनुमति. Centrifugation द्वारा किसी भी अघुलनशील सामग्री मात्रा का ठहराव शाही सेना के लिए पूर्व निकालें. अभिकर्मक कदम के साथ आगे बढ़ने से पहले फिर से शाही सेना की अखंडता की जाँच करें. इस उद्देश्य के लिए, एक 1% agarose जेल (चित्रा 3) में नमूना की 100-300 एनजी की राशि चलाते हैं. 1.2 Raw264.7 कोशिकाओं में शाही सेना की मध्यस्थता अभिकर्मक नियॉन द्वारा रिकवरी: एक स्वतंत्र सेल लाइन में MNV संक्रामक virions की वसूली के लिए यह संभव है Raw264.7 नियॉन अभिकर्मक प्रणाली (Invitrogen) का उपयोग कर कक्षों में छाया MNV प्रतिलिपि electroporate. Raw264.7 MNV संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील कोशिकाओं रहे हैं, वायरस प्रतिकृति और बाद में फिर से संक्रमण के कई दौर समर्थन. एक परिणाम के रूप में, ठेठ पैदावार 10 मिलीग्राम प्रति 5 संक्रामक इकाइयों से अधिक में 48 घंटे के बाद 24 घंटे के बाद, लेकिन> 10 7 संक्रामक इकाइयों पर अभिकर्मक शिखर पर दृष्टिकोण होगा. ट्रॅन से पहले एक दिनएक अनुमान के अनुसार 50% confluency sfection, बीज Raw264.7 कोशिकाओं. आम तौर पर कोशिकाओं के दो T75 बोतल 3 transfections के लिए आवश्यक हैं. अभिकर्मक के दिन, है Dulbecco बार संशोधित ईगल (DMEM) के मध्यम से युक्त 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) में सेल monolayers को कुरेदना, आप सुनिश्चित करने के दोहराया pipetting द्वारा एक एकल कोशिका निलंबन उत्पन्न. व्यवहार्य कोशिकाओं की एकाग्रता का निर्धारण एक अलाभकारी कोशिकाओं लेबल trypan नीला बहिष्कार का उपयोग करने के लिए रुधिरकोशिकामापी में. गोली 5 मिनट और उन्हें 8 10 6 कोशिकाओं / एमएल एक्स के अंतिम एकाग्रता में DMEM 10% एफसीएस युक्त में resuspend के लिए कोशिकाओं +१,२०० एक्स जी. बस अभिकर्मक अभिकर्मक और उन्हें +१,२०० एक्स जी पर गोली प्रति 2 मिनट के लिए कक्षों की अशेष भाजक 1 मिलीग्राम के लिए पहले. मीडिया निकालें और पीबीएस के 500 μl (2 मिलीग्राम + Ca / 2 के बिना) में कोशिकाओं को धोने. नीचे कोशिकाओं को फिर से 2 मिनट के लिए 1200 एक्स जी पर स्पिन. नोट यह सलाह दी जाती है DMEM में संभव के रूप में के रूप में लंबे समय के लिए कोशिकाओं को रखनेपीबीएस में समय की लंबी अवधि के लिए भंडारण के रूप में सेल व्यवहार्यता और अभिकर्मक दर समझौता हो सकता है. ट्यूब से पीबीएस निकालें और 6 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल अंतिम एकाग्रता के लिए मेजबान समाधान की 130 μl (नियॉन अभिकर्मक प्रणाली किट, Invitrogen) जोड़ें. देखभाल करने के लिए जो अभिकर्मक और समझौता सेल अस्तित्व के दौरान चिन्गारी निकालना कारण होगा बुलबुले के गठन से बचने कोशिकाओं resuspend लिया जाना चाहिए. कोशिकाओं (चित्रा 2) छाया MNV प्रतिलिपि की उचित राशि के लिए, आम तौर पर छाया शाही सेना के 1.3 μg resuspended कोशिकाओं और मिश्रित धीरे 130 μl जोड़ा जाता है. फिर, 100 μl नियॉन अभिकर्मक टिप में मिश्रण की 100 μl इकट्ठा. विशेष देखभाल करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले electroporation क्युवेट (नियॉन अभिकर्मक प्रणाली किट 100 μl टिप) का गठन कर रहे हैं के रूप में इस प्रयोग की विफलता का कारण बन जाएगा करने के लिए लिया जाना चाहिए. +१,७०० वी पर 25 मिसे, एन के लिए एक नाड़ी का उपयोग कोशिकाओं Electroporateजो नमूना में बुलबुले की उपस्थिति का संकेत होगा स्पंदन के दौरान स्पार्क्स के अभाव suring. चिन्गारी निकालना मामले में हो जाना चाहिए, नमूना त्यागें और अभिकर्मक दोहराना. एक Eppendorf ट्यूब में एंटीबायोटिक मुक्त DMEM युक्त 10% एफसीएस की 1 मिलीग्राम से युक्त कोशिकाओं रिलीज. नोट: प्रत्येक टिप तीन बार ऊपर से reused कर सकते हैं एक ही शाही सेना के नमूने के साथ अगर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की बड़ी संख्या की आवश्यकता है. इसके बाद, स्वतंत्र prewarmed एंटीबायोटिक मुक्त DMEM के एक उचित मात्रा में 10% है FCS युक्त युक्त कुओं में ट्यूब से कोशिकाओं को वितरित. एक सामान्य मार्गदर्शन के रूप में, सेल 1.2.8 चरण के दौरान उत्पन्न निलंबन की 150 μl 24 पकवान prewarmed DMEM का 0.5 मिलीग्राम से युक्त थाली के एक अच्छी तरह से एकल के लिए पर्याप्त हैं, जबकि 300 μl 12-पकवान थाली की एक अच्छी तरह के लिए उपयुक्त हैं prewarmed DMEM के 1 मिलीग्राम से युक्त. 37 कोशिकाओं सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 10% 24 से 72 घंटे के लिए सीओ 2. फिर, एक (या अधिक) के द्वारा कोशिकाओं से संक्रामक virions जारीस्थिर और पिघलना चक्र और नमूने में वायरस अनुमापांक या तो पट्टिका परख या TCID50 का उपयोग का निर्धारण. नोट करें कि lysates centrifugation द्वारा अधिकतम गति से या एक .22 माइक्रोन ताकना फिल्टर के माध्यम से अपने अनुमापन के लिए पूर्व फ़िल्टरिंग द्वारा 1-2 मिनट के लिए स्पष्ट किया जाना चाहिए. आमतौर पर, MNV लगभग 1 एक्स 10 24 के बाद अभिकर्मक घंटे में 6 TCID50/ml और 1 एक्स 9 10 72 के बाद अभिकर्मक बजे की titres तक पहुँचता है. उपस्थिति और pT7 में शुरू परिवर्तन की स्थिरता: MNV 3'Rz के आम तौर पर 2 से 5 Raw264.7 कोशिकाओं में अतिरिक्त मार्ग के बाद बचाया वायरस अनुक्रमण द्वारा निर्धारित कर रहे हैं. BHK-21 कोशिकाओं में 1.3 lipofection द्वारा रिकवरी: छाया टेप से संक्रामक MNV की वसूली के लिए एक और अधिक प्रत्यक्ष और अक्सर अधिक लागत प्रभावी तरीका lipofection (2000 Lipofectamine, Invitrogen) के माध्यम से है. यह देखते हुए कि Raw264.7 कोशिकाओं लिपिड आधारित दृष्टिकोण का उपयोग transfect मुश्किल कर रहे हैं हम सामान्य रूप से अन्य संगठनों का उपयोग करेंआसान एर मकान-21 है जो एक अमर लाइन बच्चा हम्सटर गुर्दे fibroblasts से व्युत्पन्न है के रूप में सेल लाइनों transfect करने के लिए. हमारी प्रयोगशाला में एक मानक दृष्टिकोण के रूप में हम BSR-T7 कोशिकाओं, मकान – 21 सेल लाइन के एक व्युत्पन्न का उपयोग करें, के रूप में के रूप में इन कोशिकाओं transfect और MNV प्रतिकृति का समर्थन करने के लिए आसान कर रहे हैं, वे एक उपयुक्त रिसेप्टर की कमी करने की अनुमति देते फिर से संक्रमण के कई दौर . एक परिणाम के रूप में, इस प्रणाली से उत्पन्न वायरस उपज वायरस की प्रतिकृति का एक चक्र का एक संकेत है. यह दृष्टिकोण विशेष रूप से उपयोग की है जब वायरस वसूली पर उत्परिवर्तन के प्रभाव का परीक्षण कर यह कई transfections नियॉन की मध्यस्थता अभिकर्मक के लिए और भी विशेषज्ञ उपकरणों की आवश्यकता नहीं है तुलना में काफी कम लागत में प्रदर्शन की अनुमति देता है. यह ध्यान देने योग्य बात है कि अन्य मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं 293T के रूप में आसानी से उपलब्ध सेल लाइनों भी MNV लेकिन अभिकर्मक शर्तों के कुशल वसूली का समर्थन पहले कुशल शाही सेना वितरण सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए लायक है. क्लोम – रसBHK-21 कोशिकाओं (या BSR-T7 कोशिकाओं), 7.5 बीज 10 x 35 मिमी व्यास पकवान में एंटीबायोटिक मुक्त विकास मीडिया में 5 कोशिकाओं और 37 ° C पर 10% रातोंरात सीओ 2 के साथ कोशिकाओं को सेते हैं. की एक monolayer बनना प्रत्येक थाली में कोशिकाओं की मात्रा डबल अगर transfections को बोने के रूप में एक ही दिन के लिए योजना बनाई है, और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% सीओ 2 के साथ 2-3 घंटे के लिए थाली करने के लिए पालन करने के लिए अनुमति देते हैं. नोट करें कि अन्य कोशिकाओं है कि इस दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त हैं मानव 293T कोशिकाओं, मानव hepatocellular कार्सिनोमा Huh7 कोशिकाओं और अफ्रीकी हरी बंदर Cos7 कोशिकाओं में शामिल हैं. कोशिकाओं से मीडिया निकालें और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना ताजा मीडिया के 3 मिलीग्राम के साथ बदलने के लिए अभिकर्मक की अधिकतम दक्षता सुनिश्चित करने के लिए. ऑप्टी सदस्य (Invitrogen) 100 μl में छाया MNV प्रतिलिपि की 1-2 μg का एक मिश्रण तैयार है और यह 2000 Lipofectamine पहले Opti-सदस्य के 100 μl में मिश्रित 4 μl के साथ मिश्रण. यह pipetting ऊपर और नीचे 15 बार नमूना मिश्रण अच्छी तरह से. छुट्टीकमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मिश्रण. अभिकर्मक सेल monolayer की एक बूंद के लिहाज से फैशन में छाया MNV टेप वाले परिसरों में जोड़ें और धीरे सीधा दिशाओं में थाली हिला. 37 कोशिकाओं सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 10% 24 से 72 घंटे के लिए सीओ 2. बाद में, फ्रीज द्वारा कोशिकाओं से संक्रामक virions और जारी विगलन और पट्टिका परख या TCID50 द्वारा वायरस अनुमापांक निर्धारित. लगभग 1 x 10 6 TCID50/ml ठेठ पैदावार तक पहुँच रहे हैं. 2. सीडीएनए से संक्रामक MNV के प्रत्यक्ष T7 शाही सेना पोलीमरेज़ व्यक्त कक्ष में रिकवरी इस प्रोटोकॉल के लिए एक संक्रामक प्लाज्मिड शरण पूरा एक T7 कोशिकाओं में व्यक्त पोलीमरेज़ द्वारा जीनोमिक सीडीएनए अनुक्रम प्रतिलेखन से कोशिकाओं में MNV की वसूली की अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किया गया है. विभिन्न सेल लाइनों को इस दृष्टिकोण से संक्रामक MNV ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है यद्यपि हम आम तौर पर BHK-21 और BSR-T7 CE के साथ उच्चतम पैदावार प्राप्त15 और LLS. आम तौर पर हम BSR-T7 कोशिकाओं के उपयोग के बाद से वे पैतृक मकान क्लोन लाइन की तुलना में तेजी से बढ़ने. कोशिकाओं fowlpox T7 शाही सेना (FPV-T7) के पोलीमरेज़ जो 18 एक सहायक वायरस के रूप में कार्य वायरल शाही सेना और संक्रामक वायरस (चित्रा 4) के बाद वसूली की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए एन्कोडिंग (FPV) से संक्रमित हैं. : FPV-T7 सहायक के अभाव में MNV 3'Rz BSR-T7 अनिवार्यता से व्यक्त T7 शाही सेना पोलीमरेज़ कोशिकाओं हालांकि, इस अभिव्यक्ति लिए pT7 की अभिकर्मक के बाद संक्रामक MNV बचाव के लिए पर्याप्त नहीं है. के रूप में इस प्रणाली से ठेठ पैदावार कम से कम 10 गुना ऊपर वर्णित की तुलना में कम कर रहे हैं, इस दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए स्क्रीनिंग म्यूटेंट की तेजी से विधि दुर्बल म्यूटेशन की पहचान की अनुमति नहीं करता है. आमतौर पर इस विधि से पहले एक सीडीएनए निर्माण की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. या तो एक का निर्माण करना चाहिए संक्रामक वायरस का उत्पादन करने में विफल या जंगली प्रकार के संक्रामक क्लोन की तुलना में निचले स्तर पर वायरस उपज दिखाई देते हैं, तो शाही सेना आधारित approaऊपर वर्णित चर्चा शुरू की है. BHK-21 कोशिकाओं (या BSR-T7 कोशिकाओं) और 7.5 x 10 एंटीबायोटिक मुक्त विकास मीडिया में 35 मिमी पकवान में 5 कोशिकाओं और कोशिकाओं को सेते हैं 37 डिग्री सेल्सियस और 10% सीओ रातोंरात 2 बीज की एक monolayer Trypsinise के. प्रत्येक थाली में कोशिकाओं की मात्रा डबल अगर transfections के बोने के रूप में एक ही दिन के लिए योजना बनाई है जोड़ें, और कोशिकाओं को 2-3 घंटे के लिए 37 में थाली करने के लिए पालन करने की अनुमति डिग्री सेल्सियस और 10% सीओ 2. सेल संस्कृति मीडिया निकालें और एक अच्छी तरह FPV-T7 के 700 μl (चित्रा 4). संक्रमण के एक ~ 0.5 Pfu प्रति सेल,, प्राथमिक चिकन भ्रूण fibroblasts पर titrations पर आधारित (MOI), बहुलता आम तौर पर प्रयोग किया जाता है. लेकिन यह ध्यान देने योग्य बात है कि प्राथमिक fibroblasts में बड़े सहायक वायरस की नई तैयारी कार्यात्मक लिए कुशल वायरस वसूली के लिए आवश्यक खुराक निर्धारित titrated कर रहे हैं लायक है. प्रचार और FPV-T7 के अनुमापन के लिए प्रोटोकॉल पहले किया गया है 18 में वर्णित है. में37 डिग्री सेल्सियस और 1 घंटे के लिए 10% सीओ 2 cubate FPV-T7 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए अनुमति देने के लिए. फिर, एंटीबायोटिक मुक्त DMEM से युक्त 10% है FCS 2 मिलीलीटर जोड़ने और 37 पर एक अतिरिक्त घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 10% सीओ 2 T7 शाही सेना पोलीमरेज़ अभिव्यक्ति की अनुमति है. संक्रामक प्लाज्मिड की अभिकर्मक के साथ आगे बढ़ना करने के लिए, सबसे पहले संक्रमित कोशिकाओं से मीडिया को दूर करने के लिए, मीडिया के 2 मिलीग्राम (एंटीबायोटिक मुक्त DMEM में 10% है FCS) के साथ धो, और अंत में मीडिया के 3 मिलीग्राम के साथ सेल monolayer को कवर. एंटीबायोटिक दवाओं के मीडिया में जोड़ा नहीं जा के बाद से वे 2000 Lipofectamine (Invitrogen) की दक्षता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं चाहिए. जंगली प्रकार के 1 μg का एक मिश्रण तैयार MNV सीडीएनए प्लाज्मिड संक्रामक (जैसे pT7: 3'Rz MNV) ऑप्टी सदस्य (Invitrogen) 100 μl और यह 2000 Lipofectamine की 4 μl के साथ मिश्रण में (Invitrogen) पहले 100 का μl के साथ मिश्रित ऑप्टी सदस्य (Invitrogen). प्रतिक्रिया यह pipetting ऊपर और नीचे 15 बार अच्छी तरह से और मिश्रण कमरा टेम्पे में मिश्रण रखें20 मिनट के लिए rature. परिणामस्वरूप अभिकर्मक मिश्रण फिर से जोड़ा जाना चाहिए सेल monolayer ड्रॉप – बुद्धिमान और प्लेट धीरे सीधा दिशाओं में हिल जाना चाहिए. 37 में FPV T7 संक्रमित, MNV प्लाज्मिड ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 10% 24 से 72 घंटे के लिए सीओ 2. संक्रामक प्लाज्मिड pT7 साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं MNV 3'Rz आम तौर पर 1 एक्स 10 4 से 5 एक्स 10 4 TCID50/ml से titres प्रस्तुत करना. 3. प्रतिनिधि परिणाम दोनों रिवर्स आनुवंशिकी दृष्टिकोण सेल संस्कृति में संक्रामक MNV की वसूली के लिए अत्यधिक कुशल के रूप में चित्रा 5 में दिखाया गया है. 10 5 TCID50/ml अधिक titres साथ संक्रामक MNV छाया MNV शाही सेना के Raw264.7 कोशिकाओं में अभिकर्मक के बाद 24 घंटे में बरामद कर रहे हैं. इसी तरह, संक्रामक प्लाज्मिड pT7 की अभिकर्मक: बीएसआर-T7 कोशिकाओं में MNV 3'Rz पहले सहायक FPV व्यक्त T7 (FPV-T7) के वायरल titres के नेतृत्व में काफी हद तक excee से संक्रमितडिंग 10 4 TCID50/ml (चित्रा 5). सिंथेटिक शाही सेना और डीएनए अणु के साथ प्राप्त इन वायरल अनुमापांक के मूल्यों उन प्राकृतिक VPg से जुड़े एक ही कोशिकाओं (चित्रा 5) में संक्रामक virions से अलग शाही सेना को शामिल transfections में प्राप्त करने के लिए समान हैं. इन परिणामों रिवर्स आनुवंशिकी यहाँ वर्णित करने के लिए आनुवंशिक रूप से सेल संस्कृति में MNV वेरिएंट परिभाषित ठीक दृष्टिकोण के उच्च दक्षता पर प्रकाश डाला. आकृति 1. MNV जीनोम और संक्रामक वायरस की वसूली के लिए प्लाज्मिड का चित्रण, जीनोम संगठन MNV की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. प्रत्येक क्षेत्र कोडन प्रोटीन एक सफेद बॉक्स के रूप में सचित्र है. ORF1 7 विभिन्न गैर संरचनात्मक प्रोटीन है कि (NS1 करने के लिए / 2 NS7) के अग्रदूत polyprotein से आत्म – proteolytic प्रसंस्करण के बाद जारी किया जाता है में अनुवाद किया है. ओआरएफ 3, 2 ओआरएफ प्रमुख capsid VP1 प्रोटीन encodes के मामूली टोपी एन्कोडसिड में VP2 प्रोटीन, और ORF4 ORF2 कोडिंग क्षेत्र के साथ अतिव्यापी डाह VF1 कारक encodes. जीनोमिक और subgenomic RNAs चर लंबाई के अपने '3 सिरों पर एक Pólya पूंछ होते हैं. बी, प्लास्मिड युक्त MNV सीडीएनए हमारे रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण (pT7: 3'Rz MNV) में इस्तेमाल किया. सीडीएनए MNV इसके 3 'के अंत में 26 अवशेषों के Pólya पूंछ से जुड़े हुए है. MNV सीडीएनए अनुक्रम तुरंत नीचे की ओर एक छोटा T7 प्रमोटर अनुक्रम, T7 संचालित प्रतिलेखन की अनुमति, और एक अद्वितीय Nhe है मैं साइट और इसके बाद एक ribozyme स्वयं cleaving के लिए कोडिंग के एक डीएनए अनुक्रम की नदी के ऊपर स्थित है. इन दृश्यों 3 'अंत में जीनोमिक Pólya पूंछ वर्तमान के बाद सही आरएनए प्रतिलेखन समाप्ति सुनिश्चित करने के लिए कर रहे हैं. चित्रा 2. लिखित और इन विट्रो में छाया हुआ संक्रामक MNV की शाही सेना से वसूली के लिए प्रोटोकॉल का अवलोकन प्लाज्मिड pT7: MNV 3'Rz के तुरंत नीचे की ओर linearised हैMNV जीनोमिक Nhe मैं प्रतिबंध एंजाइम (चरण 1) का उपयोग कर अनुक्रम की. डीएनए शोधन के बाद, MNV शाही सेना टेप T7 शाही सेना पोलीमरेज़ (चरण 2) का उपयोग करके इन विट्रो में उत्पन्न कर रहे हैं. प्रतिलेखन उत्पादों को आम तौर पर 2.5 3KB के एक स्पष्ट पर गतिशीलता के साथ चलाने के एक गैर denaturing 1% agarose जेल (3 कदम, चित्रा 3). टेम्पलेट डीएनए एक वाणिज्यिक RNase मुक्त DNase का उपयोग कर समाप्त हो रहा है. आरएनए तो LiCl वर्षण (चरण 4) द्वारा मुक्त न्यूक्लीओटाइड्स से शुद्ध. शुद्ध शाही सेना उत्पाद तो इन विट्रो में हो सकता है जा रहा है कि पहले 65 में गर्म के बाद छाया डिग्री सेल्सियस माध्यमिक शाही सेना संरचनाओं (चरणों 5-6) प्रकट करना. तेज़ी LiCl द्वारा शुद्धि के बाद, शाही सेना या तो Raw264.7 (नीयन अभिकर्मक प्रणाली, Invitrogen) के कोशिकाओं या बीएसआर-T7 कोशिकाओं (Lipofectamine, 2000 Invitrogen) के (7-8 कदम) में में ट्रांसफ़ेक्ट है. सेल के अंदर एक बार, छाया शाही सेना टेप वायरल प्रोटीन है जो नए MNV शाही सेना अणु के टेप में वायरल प्रतिकृति उत्प्रेरित में अनुवाद किया जाएगाअपने 5 'के अंत में एक उचित VPg अणु युक्त. वायरल अनुवाद के साथ प्रतिकृति की लगातार चक्र वायरल जीनोम है जो संक्रामक virions उत्पन्न करने के लिए encapsidated जाएगा की बड़ी संख्या उत्पन्न होता है. कोशिकाओं से वायरस की रिहाई की सुविधा, स्थिर और पिघलना के एक या कई चक्र (9 कदम) प्रदर्शन कर रहे हैं. वायरल पैदावार तो TCID50 या पट्टिका परख प्रक्रियाओं द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. चित्रा 3. MNV शाही सेना प्रोटोकॉल साथ टेप अखंडता का विश्लेषण. MNV शाही सेना के एक वफ़ादारी, इन विट्रो में संश्लेषित. प्लाज्मिड pT7 MNV 3'Rz सबसे पहले Nhe मैं प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग linearised है. डीएनए शोधन के बाद, MNV शाही सेना टेप T7 शाही सेना पोलीमरेज़ (2 लेन) का उपयोग करके इन विट्रो में उत्पन्न कर रहे हैं. आरएनए तो purifi है LiCl वर्षण (3 लेन) द्वारा मुक्त न्यूक्लीओटाइड्स से एड. प्रतिलेखन उत्पादों एक गैर denaturing 1% agarose जेल पर समानांतर में 1 Kb डीएनए सीढ़ी (न्यू इंग्लैंड Biolabs, लेन 1) के लिए चलाए जा रहे हैं. गैर denaturing शर्तों के तहत वायरल टेप के सापेक्ष गतिशीलता के 2.5-3 Kb dsDNA उत्पाद के लिए इसी तरह की है. बी MNV कैपिंग के बाद शाही सेना टेप की वफ़ादारी,. MNV LiCl वर्षण (2 लेन) द्वारा पहले से शुद्ध टेप एंजाइमी (3 लेन) कैपिंग और LiCl वर्षण (4 लेन) द्वारा शुद्धि के अधीन हैं. सी, एक Agilent MNV (दूसरी लेन) टेप और छाया MNV टेप (तीसरी लेन) जो पहले किया गया है LiCl में उपजी शाही सेना 6000 नैनो चिप में विश्लेषण. एक ssRNA सीढ़ी समानांतर में चलाया जाता है. = "Pdflinebreak"> चित्रा 4. सीडीएनए से संक्रामक MNV की वसूली के लिए प्रोटोकॉल का अवलोकन प्रारंभ, BSR (या मकान)-T7 कोशिकाओं के (FPV) एक रीकॉम्बीनैंट fowlpox है वायरस जीवाणुभोजी T7 शाही सेना (FPV-T7) के पोलीमरेज़ (चरण 1) के व्यक्त के साथ संक्रमित हैं. संक्रमित कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए incubated रहे हैं आगे के इलाज से पहले FPV प्रोटीन की अभिव्यक्ति है जो पुनः संयोजक T7 शाही सेना पोलीमरेज़ (चरण 2) की अनुमति देने के लिए. बाद में, pT7: MNV 3'Rz 2000 Lipofectamine (Invitrogen) (चरण 3) का उपयोग करके कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट है. एक बार जब सेल, pT7 अंदर MNV 3'Rz T7 शाही सेना पोलीमरेज़ जो synthesises MNV शाही सेना टेप (चरण 4) द्वारा मान्यता प्राप्त है. एक स्व cleaving जीनोम की 3'end से पर δ – ribozyme अनुक्रम की उपस्थिति की गारंटी देता है प्रतिलेख 3 'टीerminus Pólya पूंछ (5 कदम) के बाद स्थित है. कुछ वायरल टेप intracellularly से FPV कैपिंग एंजाइम (6 कदम) से छाया हुआ हैं. परिणामस्वरूप MNV छाया टेप MNV प्रोटीन जो MNV टेप प्रतिकृति उत्प्रेरित उत्पन्न करने के लिए अनुवाद किया जाएगा. नव संश्लेषित MNV शाही सेना अपने 5 'के अंत में एक उचित VPg अणु युक्त अणुओं वायरल अनुवाद है जो अंत में संक्रामक encapsidated वायरस की पीढ़ी में परिणाम कर सकते हैं के साथ प्रतिकृति की लगातार चक्र से गुजरना होगा. कोशिकाओं से वायरस की रिहाई की सुविधा, स्थिर और पिघलना के एक या कई चक्र (चरण 7) प्रदर्शन कर रहे हैं. वायरल पैदावार तो TCID50 या पट्टिका परख प्रक्रियाओं द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. चित्रा 5 वायरस रिवर्स अलग दृष्टिकोण आनुवंशिकी पाठ में वर्णित से प्राप्त titres के प्रतिनिधि परिणाम. ग्रे सलाखों के वायरस नियॉन के बाद 24 घंटे में प्राप्त titres का प्रतिनिधित्व करते हैं2 एक्स 10 6 Raw264.7 कोशिकाओं, या के बाद की – अभिकर्मक Lipo-2 एक्स 10 6 BSR साथ इन विट्रो में लिखित और छाया MNV शाही सेना-T7 कोशिकाओं के अभिकर्मक. 2 एक्स 6 10 BSR T7 के साथ 2 घंटे fowlpox वायरस पुनः संयोजक T7 पोलीमरेज़ (FPV-T7) के व्यक्त करने के लिए पहले से संक्रमित कोशिकाओं में MNV 3'Rz (सीडीएनए MNV): सफेद सलाखों वायरस आमतौर पर pT7 की lipofection के बाद प्राप्त अनुमापांक का प्रतिनिधित्व करते हैं. कच्चे और BSR-T7cells के में अभिकर्मक के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, हम आम तौर पर MNV से संक्रमित कोशिकाओं जो VPg से जुड़े MNV शाही सेना के उच्च स्तर को रोकने से निकाली गई शाही सेना के 2 μg का उपयोग करें. नकारात्मक नियंत्रण या तो MNV आरएनए या pT7 के साथ बाहर ले किया गया है: MNV 3'Rz एक frameshift (एफ / एस) उत्परिवर्तन जो प्रतिकृति abrogates है, कोई detectable वायरस (नहीं दिखाया डेटा) में जिसके परिणामस्वरूप कूटबन्धन.

Discussion

यहाँ हम दो अलग अलग रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण है कि सेल संस्कृति में संक्रामक MNV की वसूली की अनुमति सचित्र है. दोनों दृष्टिकोण प्रभावी ढंग से की छाया MNV टेप है कि तो सेलुलर ribosomes द्वारा मान्यता प्राप्त कर रहे हैं की पीढ़ी के माध्यम से वायरल शाही सेना जीनोम के 5 'अंत VPg की covalently लिंकेज के लिए पूर्ण आवश्यकता बाईपास enzymatically कैपिंग के बाद इन विट्रो प्रतिलेखन में में कुशल है T7 शाही सेना पोलीमरेज़, में जो टेप FPV कैपिंग एंजाइमों द्वारा छाया हुआ जा सकता है व्यक्त की कोशिकाओं में संक्रामक plasmids के प्रतिलेखन से संक्रामक MNV की वसूली. वायरस इन रिवर्स आनुवंशिकी सिस्टम के साथ बरामद titres इन वायरल संक्रमित कोशिका ¹⁷ संस्कृतियों (चित्रा 5) से VPg से जुड़े शुद्ध शाही सेना की अभिकर्मक द्वारा प्राप्त करने के लिए इसी तरह की हैं. अनुमोदक Raw264.7 कोशिकाओं में छाया MNV शाही सेना की अभिकर्मक transfectio शामिल प्रयोगों की तुलना में एक वायरस केवल 1 लॉग कम अनुमापांक प्रदानसंक्रमित कोशिकाओं से युक्त वायरल VPg से जुड़े शाही सेना (चित्रा 5) से कुल शाही सेना n. इस तथ्य को आगे की जांच के लिए प्रोत्साहित करने के लिए तय है कि इन सिस्टम द्वारा उत्पन्न टेप के 5 'अंत तक एक VPg अणु के अलावा वायरस की पैदावार में वृद्धि हुई है जो कार्यात्मक VPg से जुड़े कोशिकाओं में MNV संक्रामकता अंतर्निहित पहलुओं को प्रकट कर सकते में परिणाम सकता है. फिर भी, हम इस रिवर्स आनुवंशिकी प्रणाली के संबंध में के रूप में एक अत्यधिक कुशल अन्य आरएनए वायरस के लिए तुलनीय एक रिवर्स आनुवंशिकी सिस्टम वर्तमान में प्रयोग किया है जो में इन विट्रो लिखित शाही सेना में केवल 10-100 virions ^{19, 20 के} साथ वास्तविक संक्रमण की तुलना में कम titres की वसूली की अनुमति देता है.

कुल मिलाकर, वर्तमान तरीके norovirus आणविक जीव विज्ञान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण कदम आगे का गठन और उपकरणों के साथ हमें प्रदान करने के लिए प्रोटीन और norovirus जीनोम में संरक्षित शाही सेना रूपांकनों के कार्यात्मक भूमिका की जांच. इन तरीकों को पहले से ही ग के साथ संयुक्त कर दिया गया हैकम से कम 10 ^{4 दिन, 21} में चूहों urrent माउस मॉडल उपलब्ध है और दिखाया कि MNV संक्रामक सीडीएनए से बरामद करने के लिए> 80% STAT1 / घातक संक्रमण पैदा करने में सक्षम है. हम व्यवहार्य प्रोटीन capsid और एक polypyrimidine अलग मेजबान (PTB और PCBP) के कारक है कि vivo में ^{21, 22} में एक कुछ तनु phenotypes प्रदर्शन के बंधन में शामिल पथ के murine norovirus म्यूटेंट बरामद किया है इस प्रणाली का उपयोग करना. इसके अलावा, हम हाल ही में दिखा दिया है कि वायरस से ORF4 VF1 प्रोटीन सेल संस्कृति में दोहराने कुशलता से व्यक्त करने की क्षमता है लेकिन फिर कमी WT MNV ⁸ के लिए सम्मान के साथ चूहों में ग़ुस्सा कम कर दिया है. ये अध्ययन हमें मानव noroviruses की तनु संस्करण MNV अध्ययन जो संभावित वैक्सीन उम्मीदवारों के रूप में जांच की जा सकता है के आधार पर डिजाइन करने के लिए प्रोत्साहित करते हैं.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Lithium chloride precipitation solution	Ambion	AM9480
RNA storage solution	Ambion	AM7000
MEGAscript T7 script	Ambion	AM1333
ScriptCap m7G Capping System	Epicentre Biotechnologies	SCCE0610
Neon transfection system	Invitrogen	MPK5000
Neon transfection system kit	Invitrogen	MPK1025
Opti-MEM I	Invitrogen	31985070
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668-027
Agilent RNA 600 Nano kit	Agilent	5067-1511
Agilent 2100 bioanalyzer	Agilent	G2939AA
Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit	GE Healthcare	28-9034-70
RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7	Promega	P1300