Den hidtil ukendte protokol beskrevet i den foreliggende undersøgelse tillader selektiv detektion af lungemetastaser ved enkeltcelle-opløsning i mus efter kombineret<em> In-situ</em> Lunge perfusion og fiksering og X-gal-farvning af<em> LacZ</em>-Mærkede tumorceller.
Metastase er den vigtigste dødsårsag i de fleste kræftformer og dermed en hovedfokus i kræftforskning. Men påvisning af micrometastases af radiologisk billeddannelse og succes i deres terapeutiske udryddelse er stadig begrænset.
Mens dyremodeller har vist sig at være uvurderlige værktøjer for kræftforskning 1, overvågning / visualisering af micrometastases fortsat en udfordring og unøjagtig vurdering af metastatisk spredning i prækliniske studier potentielt fører til skuffende resultater i kliniske forsøg 2. Der er derfor stor interesse for raffinering fremgangsmåderne til endelig at muliggøre reproducerbar og pålidelig detektion af metastaser ned til enkeltcelle-niveauet i normalt væv. Det primære fokus er derfor på teknikker, som muliggør påvisning af tumorceller in vivo, såsom mikro-computer tomografi (micro-CT), positronemissionstomografi (PET), bioluminescens eller fluorescensimagografi <sup> 3,4. Vi i øjeblikket at optimere disse teknikker til in vivo monitorering af primær tumorvækst og metastase i forskellige osteosarkom modeller. Nogle af disse teknikker kan også anvendes for ex vivo analyse af metastase ved siden af klassiske metoder som qPCR 5, FACS 6 eller forskellige histologisk farvning. Som benchmark, har vi etableret i den foreliggende undersøgelse den stabile transfektion eller transduktion af tumorceller med lacZ-genet koder for det bakterielle enzym β-galactosidase, som metaboliserer det kromogene substrat 5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D -galactopyranosid (X-Gal) til en uopløselig indigo blåt farvestof 7 og tillader meget følsom og selektiv histokemisk blåfarvning af tumorceller i musevæv ex vivo ned til enkeltcelleniveau som vist her. Dette er en billig og ikke udstyr-intensive værktøj, som muliggør en præcis validering af metastase 8 i undersøgelser vurderer ny enticancer terapier 9-11. En begrænsende faktor af X-gal-farvning er lav kontrast til fx blod-relateret rødfarvning af godt vaskulariserede væv. I lungevæv dette problem kan løses ved in-situ lunge perfusion, en teknik, der for nylig blev indført ved Borsig et al. 12, der perfunderet lungerne på mus under anæstesi at fjerne dem fra blodet og at fastsætte og indlejre dem in situ under inflation gennem luftrøret. Denne metode forhindrer også sammenbrud af lungen og derved fastholder morfologien af funktionelle lungealveolerne, hvilket forbedrer kvaliteten af det væv til histologisk analyse. I den foreliggende undersøgelse beskriver vi en ny protokol, som udnytter en kombination af X-gal-farvning for lacZ-udtrykkende tumorceller og in situ perfusion og fiksering af lungevæv. Denne raffinerede protokol giver mulighed for høj følsomhed detektion af enkelte metastatiske celler i lungerne og aktiveret os i en nylig undersøgelse til detect "sovende" lunge mikrometastaser i en musemodel 13, som oprindeligt blev beskrevet at være ikke-metastatisk 14.
De her præsenterede resultater i Dunn/LM8 muse OS model demonstrere magt af den nyligt etablerede metode, der kombinerer X-Gal farvning af lacZ-mærkede tumorceller med in-situ perfusion / fiksering af lungevæv. Denne kombination af de to teknikker giver høj følsomhed påvisning af micrometastatic læsioner ned til enkeltcelle-niveau og også forbedrer visualiseringen af macrometastases på lungeoverfladen (fig. 1) samt i lungesnit (fig. 2). Mens X-gal-farvning tillader også påvisning af (mikro) metastaser i andre organer, in situ perfusion / fiksering forbedrer detekterbarheden af metastatiske foci i andre væv end lungen kun lidt på grund af den naturlige blod-og vævs-relateret farve af disse organer 13. Selv om perfusionen angår et andet organ, fx leveren, vil fjernelse af blodet kun delvis forbedre kontrasten betlem X-gal-farvning, og den naturlige farve af organet. Men den kan anvendes på enhver type af lacZ-mærkede tumorceller, vil dramatisk forbedre detekterbarheden af lungemetastase ned til niveauet af hvilende encellede mikrometastaser og muliggør en nem og pålidelig kvantificering af makro-og mikrometastaser. En begrænsning ved denne fremgangsmåde og alle andre teknikker, der er baseret på reportergener, herunder luciferase og fluorescerende proteiner, er stabiliteten af transgen ekspression. Som vist i figur 2d er ikke alle tumorceller i macrometastatic foci farves blå, hvilket indikerer en mangel på beta-galactosidaseaktivitet. Dette kan være relateret til nekrose, men det er mere sandsynligt på grund af et tab af transgen ekspression. Vi observerede, at Dunn og GL8 celler er meget effektive i nedregulering af lacZ og andre transgener selv under kontinuerlig selektion for ekspression. Vi skiftede derfor i de seneste undersøgelser for murin K12og K7M2 og de menneskelige HOS, 143B og Saos-2 osteosarcom-cellelinier, som alle holdes stabilt lacZ-ekspression in vitro og in vivo op til 100% over tid.
Når stabil lacZ-ekspression er garanteret, kan denne teknik anvendes i studier med gen-manipulerede tumorceller, bl.a. for at mekanistisk undersøge processen med væv kolonisering 13 samt til udvikling og afprøvning af nye behandlingsformer med henblik på udryddelse af metastatiske læsioner 15 af 16. Desuden kan det tjene som et benchmark for forbedring af den aktuelle radiologiske billeddannende teknikker, såsom PET, (mikro) CT og MR, der anvendes til tidlig påvisning af metastatiske læsioner. I en nylig undersøgelse PET (ikke offentliggjort) med forskellige sporstoffer, vi verificeret in vivo påvist lungemetastaser efterfølgende ex vivo med den beskrevne protokol. I en igangværende undersøgelse med en ny lille dyr mikro-CT (SkyScan) vi er så langt ABle til påvisning af lungemetastaser in vivo ned til en størrelse på 0,5 mm og ex vivo ned til 0,3 mm, men man sigte på en opløsning på 0,1 mm. Interessant er det størrelsesgrænse, vi sat til at skelne makro-fra micrometastases ved den kombinerede fremgangsmåde til in-situ perfusion og X-gal-farvning. Dette understreger igen følsomheden og nytten af denne nemme og omkostningseffektiv teknik.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dr. Lubor Borsig (Institut for Fysiologi, Zürich Universitet) for hans råd om teknikken med lunge perfusion. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Krebsliga i Kanton Zürich, Walter L. og Johanna Wolf Foundation, Zürich, Lydia Hochstrasser Foundation, Zürich, den schweiziske National Science Foundation, SNF, Schweiz, Schweizerischer Verein Balgrist, og universitetet af Zürich.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Narketan10 (ketamine) | Vétoquinol AG | 100 mg/ml solution | |
Xylazin (xylazine) | Streuli Pharma AG | 20 mg/ml solution | |
Prequilan (acepromazine) | Fatro S.p.A. | 10 mg/ml solution | |
Bulldog Type Serrefine vascular clamp | Fine Science Tools | 18051-35 | curved, 35 mm |
Plastic cup with lid | Semadeni | 2988 | 25 ml cups with lids |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); powder | Axxora | ALX-582-002-G005 | dissolve in N,N-Di-methylformamide to 40 mg/ml, store light-protected at -20 °C |
Basic staining solution, equilibrated to pH 7.1, stored light-protected at 4 °C for max. 1 month | self-made | 100 ml/L 10xPBS, 1.64 g/L K3Fe(CN)6, 2.1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% Sodium-Deoxycholate | |
PolyFreeze Embedding Medium | Polysciences; swiss distributor: Brunschwig | 19636-1 | |
Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
Leica CM1850 cryostat | Leica Microsystems | ||
SuperFrost slides | Menzel | J1800AMNZ | |
Nuclear-Fast Red – Aluminum sulfate solution | Division Chroma Waldeck GmbH&Co KG distributor: Medite | 84-0241-00 | |
Immu-Mount | Thermo Electron, swiss distributor: Histocom | 9990412 |
Table 1. Reagents and Equipment.