Vi har utvecklat ett<em> In vitro</em> Malaria-HIV-1-infektion modell för att studera effekterna av<em> Plasmodium falciparum</em> I HIV-1-replikativa cykeln i humana primära monocythärledda makrofager. Denna mångsidiga system kan enkelt anpassas till andra primära celltyper mottagliga för HIV-1-infektion.
Plasmodium falciparum, vilka smittämnen av dödligaste formen av malaria, och humant immunbristvirus typ-1 (HIV-1) är bland de viktigaste hälsoproblemen i världen, är ansvarig för sammanlagt 4 miljoner dödsfall årligen 1. På grund av sina omfattande överlappning i utvecklingsregioner, särskilt Afrika söder om Sahara, co-infektioner med malaria och HIV-1 är vanliga, men samspelet mellan de båda sjukdomarna är dåligt förstådd. Epidemiologiska rapporter har antytt att malariainfektion övergående ökar HIV-1-replikation och ökar HIV-1 virusmängd i samarbete infekterade individer 2,3. Eftersom denna viremi förblir hög i flera veckor efter behandling med malariamedel, kan detta fenomen ha en inverkan på sjukdomsutveckling och överföring.
De cellulära immunologiska mekanismerna bakom dessa observationer har endast studerats knappast. De få in vitro-studier Investigrustningen inverkan av malaria på HIV-1 har visat att exponering för lösliga malariaantigener kan öka HIV-1-infektion och reaktivering i immunceller. Emellertid används dessa studier helcellextrakt av P. falciparum schizont scen parasiter och perifera mononukleära celler (PBMC), vilket gör det svårt att tolka vilka malaria komponent (er) var ansvarig för de observerade effekterna och vad målet värdceller 4,5. Nytt arbete har visat att exponering av omogna monocythärledda dendritiska celler till malaria pigmentet hemozoin ökar sin förmåga att överföra HIV-1 till CD4 + T-celler 6,7, men att den minskade HIV-1-infektion av makrofager 8. Att belysa denna komplexa process, en systematisk analys av samspelet mellan malariaparasiten och HIV-1 i olika relevanta humana primära cell populationer kritiskt behövs.
Flera tekniker för att undersöka effekten av HIV-1 på fagocytos av mikroorganismer och effekten av sådana patogener på HIV-1-replikation har beskrivits. Vi presenterar här en metod för att undersöka effekterna av P. falciparum-infekterade erytrocyter på replikation av HIV-1 i humana primära monocythärledda makrofager. Effekten av parasiten exponering för HIV-1-transkriptionella / translationella händelser övervakas genom användning av enkel process pseudotypade virus, i vilka en luciferasreportergen har ersatts av env-genen, medan effekten på den mängd virus frisätts av de infekterade makrofager bestämdes genom mätning av HIV-1-kapsidprotein p24 genom ELISA i cellsupernatanter.
Vi har illustrerat här två olika metoder för att analysera effekterna av malariaparasiten på HIV-1 virus cykeln, dvs genom att analysera antingen viral genuttryck eller avkomma virus produktion och replikering i monocythärledda makrofager. Liknande tillvägagångssätt har använts för andra HIV-1-parasit sam-infektioner 16. Dessa nya data är ett steg framåt i utredningen av malaria-HIV-1 co-infektioner. . I själva verket Diou et al 8 studerade effekten av hemozoin, inte levande parasiter, på HIV-1-replikering, i överensstämmelse med våra resultat, konstaterade de att hemozoin själv var tillräcklig för att hämma viral produktion av MDM, och inte MDMs.
Använda den beskrivna experimentella layout, observerade vi att P. falciparum utövar en tydlig negativ effekt på HIV-1 replikativa cykel i makrofager: en signifikant hämning av viral produktion observeras i makrofager i förväg utsatta för parasiter (Figure 2A) och en specifik inverkan parasit på viral transkription illustreras i figur 2B. Men vi kan inte lämna ut några ytterligare effekter av parasiten på viralt inträde eller fusion (decapsidation), eller på post-integration mekanismer, såsom protein syntes eller viral partikel montering och spirande. Dessutom är det möjligt att en annan effekt på HIV-1-replikering skulle erhållas om parasiten lades antingen vid samma tidpunkt eller efter MDM infektion med viruset.
Vår vitro-infektion modell ger ett kraftfullt verktyg för att utföra detaljerade undersökningar av HIV-1 / P. falciparum interaktioner i värdcellen. Till exempel en kombination av detta experimentella layout med andra tekniker, såsom kvantitativa realtid PCR, som kan rikta och kvantifiera specifika steg i viral retrotranskription och virala genomet integration i värdcellens genom, är fullt möjligt och bör ge ytterligare insights i de mekanismer som är inblandade i co-infektioner. Dessutom att vissa analyser utvärdera tidiga stegen av den virala cykeln (viral fusion, decapsidation, inträde kvantifiering) kan tillämpas på denna grundläggande protokollet för att ytterligare analysera effekten på virusreplikation. Dessa ändringar visar hur flexibelt detta protokoll är om HIV-1 kvantifiering och detektion: faktiskt även vanliga HIV-1 omvänt transkriptas kvantifiering analyser använder tritium-märkt nukleotider kan tänkas ersätta ELISA för HIV-1 p24. Förutom MDM, räknar vi med vårt system för att kunna anpassas till andra celltyper som är relevanta för HIV-1-malaria interaktioner, såsom monocyter och dendritiska celler. Det faktum att MDM är vidhäftande cellerna underlättar manipulation, vilket möjliggör enkel att tvätta av iRBC som inte har tagits in, eller som kommer i kontakt med MDM, utan att eliminera några makrofager. En sådan fördel skulle inte tillämpas på dendritiska celler och monocyter, vilka odlas i suspension, vilket komplicerar sigparation av uRBC och fria iRBC med sådana celler och som vi nu behandlar denna fråga. Vårt system skulle också vara användbara för att studera mer komplexa interaktioner såsom effekterna av Plasmodium-exponerade monocyt-härledda celler på HIV-1 virala cykeln i andra immunceller såsom CD4-positiva T-celler i samodling experiment. Slutligen kan vi protokoll vara lämplig för experiment tittar på effekten av P. falciparum iRBCs på HIV-1 reaktivering i PBMC för HIV-1 infekterade individer.
Etik meddelandet
Humana PBMC erhållna från blod av friska givare, i enlighet med riktlinjerna från kommittén bioetik för centrumet Hospitalier de l'Université Laval Research Center. Ett skriftligt godkännande erhölls från alla blodgivare.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av den kanadensiska Institutes of Health Research genom en katalysator Co-infektioner och komorbiditeter bidrag. Humana erytrocyter lämnades av centret Hospitalier de l'Université Laval blodbank.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
RPMI 1640 | Multicell | 350-000-CL | |
PBS-endotoxin free | Sigma | D8662 | |
FBS | Wisent | 080-150 | Heat-inactivated at 56 °C for 30 min |
Accutase | eBiosciences | 00-4555-56 | |
Albumax II | Gibco | 11021-037 | Dissolved in RPMI 1640, filter-sterilized |
Lymphocyte separation medium | Multicell | 305-010-CL | |
White luminometer plates | Promega | Z3291 | |
CS Macs separation columms | Miltenyi Biotech | 130-041-305 | |
VarioMacs separator | Miltenyi Biotech | 130-090-282 | |
Penicillin/Streptomycin solution | Wisent | 450-201-EL | |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
Cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.1830 | |
24-Well Cell Culture Plates | BD Falcon | 353047 | |
150 x 20 mm culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | |
M-CSF | Genscript | Z02001 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Human serum AB+ | Valley Biomedical | HP1022 | |
HBSS | Wisent | 311-505-CL | |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Luciferase Assay System | Promega | E1500 | |
Human red blood cells | Obtained purified from CHUL blood bank. |