Всеобъемлющее Профилирование Допамин регулирование в черной субстанции и вентральной области покрышки

Краткое содержание

Допамин четко регулируется в ядрах мозга, в которых содержатся клетки тела и дендриты нейронов допамина. Здесь мы опишем вскрытия и образец обработки подход для достижения максимальных результатов, и, следовательно, выводы и понимание, на допамин регулирования в мозге зародышей черной субстанции (SN) и вентральной области покрышки (VTA) у грызунов.

Аннотация

Допамин является активно изучал нейромедиатор в ЦНС. В самом деле, его участие в двигательной активности и вознаграждение поведения, связанного способствовала пять десятилетий исследования в области молекулярной недостатки, связанные с регулированием допамина. Большинство из этих запросов допамина регулирования в мозгу внимание на молекулярные основы ее регулирования в терминале поле регионах нигростриатной и mesoaccumbens пути, стриатуме и прилежащем ядре. Кроме того, такие исследования были сконцентрированы на анализе содержания допамина ткани с нормализацией только сырого веса ткани. Исследование белков, которые регулируют допамина, такие, как тирозин гидроксилазы (TH) белка, TH фосфорилирования, переносчика дофамина (DAT), и везикулярного транспортера моноаминов 2 (VMAT2) белок часто не включают в себя анализ содержания дофамина в тканях и того же образца. Умение анализировать и содержание дофамина ткани и ее регулирующих белков (в том числе пост-траnslational модификации) не только дает присущее власти интерпретации отношений допамина с уровнем белка и функции TH, DAT, или VMAT2, но распространяется также образцы экономики. Это приводит к меньшей стоимости, и тем не менее дает полное представление о молекулярной регуляции допамина практически в любой парадигме выбор следователей.

Мы ориентируемся анализа в мозге. Несмотря на то, СН и ВТА, как правило, игнорируется в большинстве исследований дофамина регулирования, эти ядра легко расчлененный с практикой. Всеобъемлющего считывания содержания допамина ткани и TH, DAT, или VMAT2 может быть проведена. Там в растущей литературы о влиянии функции дофамина в СН и ВТА на поведение, и impingements экзогенных веществ или болезненных процессов в нем ^1-5. Кроме того, такие соединения, как факторы роста оказывают глубокое влияние на допамин и дофамин-регулирование белков, в сравнительно большей степени в SN или VTA Проиллюстрируем вскрытия техника для разделения этих двух ядер и обработки образцов из расчлененных ткани, которая производит профиль выявления молекулярных механизмов регуляции допамина в естественных условиях, характерных для каждого ядра (рис. 1).

Протокол

1. Рассечение

1. На ложе из мокрого льда, охладить матрицу грызунов мозга (корональные разделы выделены 1 мм друг от друга), чашки Петри, содержащие 5 бритвы, и № 11 скальпеля. В отдельной емкости, места помечены 2 мл труб размером микроцентрифужную в сухой лед.
2. Следователь будет выбрать способ эвтаназии. У нас есть воспроизводимыми результатами проведения анестезии очень короткий с ИФ, в идеале, испаритель должны быть использованы. Однако, если нет, мы используем большой сосуд батарея с платформы. С батареи банка расположены в утвержденный вентиляционных капот, разместить ИФ-насыщенных марлевым тампоном под платформу и ждать 3-5 минут, чтобы насыти....

Обсуждение

Как указано на рисунке 1, описанные выше методы должны дать показания нескольких дофамина и его регулирующие белки TH, DAT, и VMAT2 от одного образца СН или VTA получены либо из крысы или мыши. Опять же, выгоды от проведения этого протокола в том, что следователь может получить оперативно подобранные показания о том, как допамин регулируется в естественных условиях практически в любой экспериментальной парадигмы и, тем самым, значительно сэкономить экспериментальных ресурсов за счет сокращения числа животных, н.......

Материалы

ВЭЖХ системы:

Базовая система состоит из Shimadzu LC10-ADvp ВЭЖХ насос, воды WISP 717 автоматического ввода пробы, 250 х 4,4 мм 5 микрон Spherosorb ОРВ-1 C18 обращенно-фазовой колонке (Waters), Биоаналитическая систем (БАС) TL12 двойной стеклянный углеродного электрода, два BAS LC4B электрохимических датчиков, а также воды 2 Расширение возможностей по сбору данных и системной интеграции.

Колонка поддерживается на уровне 30-45 ° C (BAS LC22A колонка нагреватель). Подвижной фазы 0,1 М фосфата натрия (рН 3,0), 0,1 мМ ЭДТА, 0,2-0,4 мм 1-Octane сульфокислоты (Eastman Kodak-), и 0,35% ацетонитрила (объем / объем), фильтруют через 0,45 микронный фильтр. Расход составляет 1,2 мл / мин. Четыре литра партии подвижной фазы, оптимизированные для разделения путем изменения рН, Octane сульфокислоты и температуры колонки. Подвижная фаза возвращается, и постоянно продувается гелием для удаления растворенного кислорода. Утилизация подвижной фазыПочти важное значение для поддержания хорошего разрешения в течение разумного периода времени. Подвижной фазы годности поддерживается с помощью реле протока (контролируется интегратор), чтобы отвлечь тратить первые 2-7 мин при каждом запуске.

Электроды поддерживается на потенциалы примерно 0,78 и 0.95V в отношении Ag/AgC1 электрода сравнения. Электрод на более высокий потенциал используется исключительно для определения триптофана (и стандартный внутренний NMDA). 0,78 V потенциал обеспечивает превосходное соотношение сигнал-шум для выявления моноаминов и соединения, кроме триптофана. Хроматограмм хранятся на жестком диске Расширение возможностей рабочих станций, а затем обрабатываются и данные передаются непосредственно в электронную таблицу Excel для расчета количества метаболитов и обобщение данных групп.

Насос: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Креста Flow. Стеклоуглерода рабочего электрода на 0,780 и 0,950 В потенциалом.
Детектор: BAS LC-4B работать в двухканальном режиме.
Данные Инв. Система: Воды Расширение возможностей Pro 2.
Инжектор: Воды WISP 717
Колонка: Воды Spherosorb ОРВ-1, 5 мкм частицы, 4,4 мм х 250 мм.

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер по каталогу
Додецилсульфата натрия (SDS)	- JT Baker	4095-02
Trizma базы	Сигма	T1503, 1 кг
Trizma HCl	Сигма	T3253, 1 кг
Глицерин	Сигма	G8773-500 мл
PVP-40	Сигма	PVP40-1 кг
DPBS	Гибко	21600-069
Tween20	Сигма	P1379-500 мл
Глицин	Сигма	G8898-1 кг
Понсо S	Fluka	81460
Bromophenol синий	Сигма	B8026-5-го поколения
Дитиотреитола	Сигма	D-9163
Белки Стандартный 2 мг BSA	Сигма	P5619-25VL
Пирс BCA белка Анализ реагентов	Thermo Fisher Scientific-	23223
Precision Plus белка Стандартный	Био Рад	161-0373
[125I]-белка, удельная активность	Перкин-Элмер

Таблица 2. Специальные реагенты.

Реагенты	Формулы
10% SDS	10 г SDS, 100 мл DI H 2 0
1% SDS (рН до 8,2)	10 мл10% SDS 60,5 мг Trizma базы 37,22 мг ЭДТА 90 мл DI H 2 0
Медные II раствор сульфата	1 г медного II сульфат 25 мл DI H 2 0
3X буфера образца	Trizma база 2,27 г SDS 6 г Дитиотреитола 0,463 г Глицерина 30 г Bromophenol Blue 10 мг DIH 2 0 (сначала добавить выше реагентов 40 мл H 2 0 в мерный цилиндр, а затем добавить H 2 0, пока объем достигает 100 мл) HCl (добавить, необходимых для достижения рН 6.85) Замораживание раствора в 50 мл 2,0 трубы. (Составляет 100 мл): Объем 3X буфера образца необходима = ½ объема SDS используется в образце.
1X Пример буфера	Развести 3X буфера образца до 1X образец буфера с помощью DI H 2 0
10X Запуск Buffer (Делает 4 л)	Trizma базы 121,1 г Глицин 577 г SDS 40 г
10X Буфер передачи: (Делает 4 л)	Глицин 360 г Trizma базы 96 г
Пунцовый цвет	Понсо С. 0,5 г Уксусная кислота 5 мл Д.И. H 2 0 95 мл
0,2% HCl решения	5,2 мл соляной кислоты в 500 мл Д.И. H 2 0
PVP-T20 Блокировка Soln. (Делает 4 л)	PVP-40 40 г DPBS 38,2 г Tween20 2 г Thimerisol 0,4 г 1М Трис рН 7,6 (60,6 г трис HCl + 13,9 г трис базы в 500 мл DI H 2 0) - 50 мл
10X Буфер Blot (Делает 4 л)	Твин-20 20 г Трис базы 14 г Трис-HCl 61 г

Отправить по почте "> Таблица 3. Анализ белка и Западной блоттинга формулы.

Тирозин гидроксилазы стандартам: калибровка TH белка и фосфорилирования стандарты, используемые в данной лаборатории получены из PC12 клеточных экстрактов, которые были проанализированы на содержание белка TH и фосфорилирования стехиометрии против ранее калиброванный TH стандарты, которые в конечном итоге возник из лаборатории д-р Джон Хейкок ¹¹ .