Denne protokollen beskriver bruk av en tangentiell flyt hul-fiber ultrafiltrasjon prøve konsentrasjon system og en varme dissosiasjon som alternative tiltak for påvisning av vannbårne<em> Cryptosporidium</em> Og<em> Giardia</em> Arter i EPA Method 1623.
Cryptosporidium og Giardia arter er to av de mest utbredte protozoer som forårsaker vannbårne diaré sykdomsutbrudd verden. For å bedre karakterisere utbredelsen av disse patogener, ble EPA Method 1623 utviklet og brukt til å overvåke nivåene av disse organismene i USA drikkevann leverer 12. Metoden har tre hoveddeler, den første er utvalget konsentrasjonen der minst 10 L av rå overflatevann blir filtrert. Organismene og fanget rusk blir deretter elueres fra filteret og sentrifugeres til videre konsentrere prøven. Den andre delen av metoden bruker en immunomagnetiske separasjon prosedyre hvor konsentrert vannprøven brukes til immunomagnetiske perler som spesifikt bindes til de Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster muliggjør spesifikk fjerning av parasitter fra konsentrert rusk. Disse (OO) cyster er så løsrevet fra de magnetiske kuler av en syre dissosiasjon proseDure. Den siste delen av metoden er immunfluorescens flekker og telling der (OO) cyster brukes på et lysbilde, beiset, og nummerert av mikroskopi.
Metode 1623 har fire børsnoterte prøven konsentrasjon systemer for å fange Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster i vann: Envirochek filtre (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV filtre (Pall Corporation), Filta-Max filtre (IDEXX, Westbrook, MA), eller kontinuerlig flyt Sentrifugering (Haemonetics, Braintree, Massachusetts). Imidlertid har Cryptosporidium og Giardia (OO) cyst inngang varierte sterkt avhengig av kilden vannet matrise og filtre brukt 1,14. En ny tangentiell flyt hul-fiber ultrafiltrasjon (HFUF) system har nylig vist seg å være mer effektive og mer robust ved å utvinne Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster fra ulike vann matriser, dessuten er det billigere enn andre patronfilter alternativs, og kan konsentrere flere patogener samtidig 1-3,5-8,10,11. I tillegg tidligere studier av Hill og kolleger vist at HFUF betydelig forbedret Cryptosporidium oocyster inngang når sammenlignes direkte med de Envirochek HV filtrene 4. Ytterligere endringer av dagens metoder har også blitt rapportert å forbedre metoden ytelsen. Skifte syre dissosiasjon prosedyren med varme dissosiasjon ble vist å være mer effektiv på å skille Cryptosporidium fra de magnetiske perler i enkelte matriser 9,13.
Denne protokollen beskriver en modifisert metode 1623 som bruker den nye HFUF filtreringssystem med varmen dissosiasjon trinnet. Bruken av HFUF med dette endret Metode er et rimeligere alternativ til dagens EPA Method 1623 filtrering alternativer og gir mer fleksibilitet ved at konsentrasjonen av flere organismer.
Tangentiell flyt hul-fiber ultrafiltrasjon er en alternativ og effektiv teknikk for den opprinnelige konsentrasjonen av Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster fra vann. Hollow-fiber ultrafiltrasjon er rimeligere enn tradisjonelle filtre. Siden det har evnen til å konsentrere Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster fra en rekke forskjellige vann matriser det er en nyttig alternativ til dagens filtrering teknikker som brukes for EPA Method 1623. Som med de fleste andre filtrering metoder, er hul-fiber ultrafiltrasjon utsatt for begroing med ekstremt grumsete prøver. Høyt vanntrykk ville følge av filteret begroing, derfor anbefales det å overvåke trykket under filtrering løp. I tillegg til Cryptosporidium oocyster og Giardia cyster, har hul-fiber ultrafiltrasjon vist seg å være i stand til å konsentrere seg bakterier og virus 1-3,5,8. Hollow-fiber ultrafiltrasjon outlined i denne metoden kan brukes til å konsentrere flere organismer i en enkelt prøve. Det er bemerkelsesverdig at å skaffe en endelig volum mellom 200 og 250 ml er den kritiske siste trinnet i konsentrasjonen prosedyren slik at ekstra Sentrifugering trinn, som kan resultere i (oo) cyste tap, unngås (trinn 2,2). Imidlertid kan slik at volumet i flasken for å slippe altfor lavt ha ugunstige effekter på inngang siden det ikke vil være nok væske volum for å tvinge alle oocyster eller cyster i retentate flasken. Derfor anbefales det å opprettholde en endelig volum mellom 200 og 250 ml.
Heat dissosiasjon er et alternativ til syre dissosiasjon trinnet i metode 1623. Denne alternative trinnet har vist seg å forbedre Cryptosporidium oocyst utvinning og redusere metoden variasjon når isolert fra enten elven eller reagens vann 9. En side-by-side-sammenligning av syre og varme dissosiasjon metoder viste at bruk av varme til dissociaTe organismene fra immunomagnetiske perlene produseres høyere gjennomsnittlig inngang for både Cryptosporidium og Giardia. I tillegg var presisjonen av Cryptosporidium og Giardia inngang bedre i prøver behandlet med varme dissosiasjon sammenlignet med syre dissosiasjon 9.
Inkorporering av HFUF som konsentrasjonen steget tillater mer fleksibilitet ved å tilby muligheten til å konsentrere seg flere organismer. I tillegg er det et rimeligere alternativ til nåværende metode 1623 filtrering alternativer.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke Ann Grimm og Michael Zimmerman for kritisk gjennomgang av dette manuskriptet og Doug Hamilton for sin teknisk support.
Equipment/Reagent | Vendor | Catalog # |
Asahi Kasei Rexeed 25 S/R wet hollow-fiber ultrafilters | Dial Medical | REXEED25S/R |
I/P 73 (Masterflex R-3603), or equivalent | Cole Parmer | EW-06408-73 |
L/S 24 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-24 |
L/S 15 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-15 |
L/S 36 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-36 |
I/P Precision Brushless Drive | Cole Parmer | EW-77410-10 |
I/P Easy Load Pump Head | Cole Parmer | EW-77601-10 |
Black HDPE Tee, 1/4″x 3/8″ x 3/8″ | US Plastics | 62064 |
Masterflex T-connector L/S 15-25 | Cole Parmer | EG-30613-12 |
Nalgene heavy-duty pp 1 L bottle | Cole Parmer | EW-06257-10 |
10 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11C |
Nalgene filling/venting cap for 1/4″ tubing, 53B | Cole Parmer | EW-06258-10 |
Pressure gauge | Cole Parmer | A-680-46-10 |
Straight coupling, NPT(F), 1/4″ | Cole Parmer | EW-06469-18 |
NPT branch tee, natural pp | Cole Parmer | A-30610-75 |
Pinch clamps, 1/2″ | Cole Parmer | EW-06833-00 |
Custom fit DIN adapters | Molded Products Corp | MPC-855NS.250 |
Ring stand | Fisher Scientific | 14-670B |
Ring stand clamps | Fisher Scientific | 05-769-6Q |
Keck ramp clamp, 14mm | Cole Parmer | EW-06835-10 |
Sodium polyphosphate | Sigma Aldrich | 305553 |
Sodium thiosulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | 72050 |
Antifoam Y-30 emulsion | Sigma Aldrich | A5758 |
Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 |
10 L Collapsible high-density polyethylene cubitainer | VWR | IR314-0025 |
Centrifuge bottle rack | Fisher Scientific | 05-663-103 |
250 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430776 |
Disposable funnel | Cole Parmer | U-6122-10 |
Wash bottle | Cole Parmer | U-06252-40 |
Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R |
Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ARIES SX4750 |
Centrifuge bucket adapters for 250 ml conical tubes | Beckman Coulter | 349849 |
200 μl large bore pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-134 |
VacuShield Filter | Gelman | 629-4402 |
5 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11D |
Dynabeads: Cryptosporidium/Giardia combo kit | IDEXX | 73002 |
50 ml conical centrifuge tubes | Falcon | 352098 |
Dynal L10 flat sided tubes | IDEXX | 74003 |
Timer | VWR | 23609-202 |
Dynal MPC-6 magnet | IDEXX | 12002D |
1 ml pipettes | VWR | 53283-700 |
1.5 ml low adhesion microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 |
1000 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P1000/DF1000ST |
100 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P100/DF100ST |
9 inch Pasteur pipettes | VWR | 14672-412 |
Dynal MPC-S magnet | IDEXX | 12020D |
Vortex | VWR | 14216-188 |
Dynabeads rotator mixer | IDEXX | 94701 |
Heat block | Fisher Scientific | 11-718-2 |
Lab Armor Beads | Lab Armor | 42370-750 |
Digital thermometer | Fisher Scientific | 15-077-60 |
Phosphate-buffer saline 1X pH 7.4 (1X PBS) | Sigma | P4417 |
Single Spot slides | IDEXX | 30201 |
Cover glass | Corning | 287018 |
EasyStain direct kit | BTF | – |
10 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P10 & DF10ST |
4′,6′-Diamidino-2-phenyl indole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 |
Clear nail polish | Fisher Scientific | S30697 |
Methanol | Fisher Scientific | L6815 |
Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 |
Incubator | Boekel Scientific | 133000 |
slide warmer | Fisher Scientific | 11-474-521 |
Immersion oil, Type A ND= 1.515 | Nikon | MXA20234 |
Nikon 90i microscope with DIC capabilities | Nikon | MBA 77000 |
Plan APO 100X oil objective | Nikon | MRD01901 |
Plan Achro 20X | Nikon | MRL00202 |
FITC filter | Nikon | 96302 |
DAPI filter | Nikon | 96301 |
X-cite fluorescence illuminator | Nikon | 87540 |
Lens paper | Nikon | 76997 |
Biohazard disposable bag | Fisher Scientific | 01-829D |
Biohazard sharps container | Fisher Scientific | 14-827-117 |
3 % hydrogen peroxide | VWR | BDH3540-2 |
Bleach | Fisher Scientific | 1952030 |
Wypall | Kimberly Clark | 34790 |